Pharmacological intervention of mitochondrial mechanisms in hemin toxicity and ferroptosis

Die zunehmende Prävalenz neurologischer Erkrankungen, wie Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer und Schlaganfälle, stellt eine wachsende Herausforderung für unsere alternde Gesellschaft dar und zählt zu den führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität. Diese Erkrankungen sind eng mit oxidativem Stress verbunden und die intensive Forschung der letzten Jahrzehnte konnte verschiedenen Zelltodmechanismen wie Apoptose, Oxytose, Ferroptose, Nekroptose und die Hemintoxizität damit verknüpfen. Dies basiert auf dem Nachweis unterschiedlicher pathophysiologischer Merkmale, darunter Lipidperoxidation, Verlust der Eisenhomöostase und Beeinträchtigung der Mitochondrien. Um ein umfassenderes Verständnis für bislang ungeklärte Faktoren und molekularen Mechanismen zu gewinnen, die zu neurodegenerativen Erkrankungen beitragen und deren gegenseitigen Verbindungen noch nicht vollständig erforscht sind, wurden in dieser Studie zahlreiche Untersuchungen im Bereich der Ferroptose durchgeführt. Im ersten Abschnitt dieser Studie wurde die mitochondriale Beteiligung an der ACSL4/LPCAT2-gesteuerten Ferroptose näher untersucht. Hierzu wurden stabil transfizierte HEK293T-Zellen mit einer Überexpression der Enzyme ACSL4 und LPCAT2 oder einem Leervektor als Kontrolle verwendet. Die Überexpression der lipidsyntheserelevanten Enzyme führte zu einer erhöhten Sensitivität gegenüber der Ferroptose-induzierenden Substanz RSL3 im Vergleich zur Kontrollzelllinie. Eine verstärkte mitochondriale Schädigung wurde durch erhöhte mitochondriale ROS- Produktion, Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials und reduzierte mitochondriale Respiration festgestellt. Diese Effekte konnten durch Inhibitoren der Ferroptose verhindert werden. Die Hemmung des überexprimierten Enzyms ACSL4 durch Thiazolidindione schützte ebenfalls vor dem Zelltod. Zur genauen Untersuchung der mitochondrialen Beteiligung wurde der VDAC1-Inhibitor Akos-22 und der mitochondriale ROS-Scavenger MitoQ eingesetzt. Beide zeigten eine hohe Wirksamkeit in den überexprimierenden Zellen und protektive Effekte auf zytosolischer und mitochondrialer Ebene. MitoQ wirkte aufgrund seiner antioxidativen Wirkung schützend und beeinflusste den Stoffwechsel. Es wurden Inhibitoren des mitochondrialen Komplexes I der Atmungskette getestet, und es wurde ein Glutamin-Entzug durchgeführt, um festzustellen, ob ein Eingriff in den Stoffwechsel ausreichend war. Diese Maßnahmen konnten jedoch nicht gegen Ferroptose schützen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die mitochondriale ROS-Produktion die ACSL4/LPCAT2-gesteuerte Ferroptose bestimmt und Mitochondrien-gerichtete Antioxidantien die Zellen davor schützen können. Im zweiten Abschnitt dieser Forschungsarbeit wurde die Verbindung zwischen Erastin- und Hemin-induzierter Ferroptose in neuronalen HT22-Zellen näher charakterisiert, wobei der Fokus auf der mitochondrialen Beteiligung lag. Es konnten Unterschiede in der Reaktion auf den FCS-Entzug festgestellt werden. Des Weiteren zeigte sich, dass der pharmakologische 12/15-LOX-Inhibitor gegen Erastin schützen konnte, jedoch gegen die Hemintoxizität wirkungslos war. Im Gegensatz dazu waren die 5-LOX-Inhibitoren gegen beide Formen der Ferroptose wirksam. Die Protektion konnte auch die durch Hemin- induzierte mitochondriale ROS-Produktion und den Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials aufhalten. MitoQ wurde erneut verwendet, um die mitochondriale ROS-Produktion genauer zu untersuchen, wobei ein Schutz gegen Erastin, aber nicht gegen die Hemin-Toxizität erreicht wurde. Auch die metabolische Intervention durch den Komplex I Inhibitor Metformin konnte die HT22-Zellen nicht vor der Hemintoxizität schützen. Dadurch kann geschlussfolgert werden, dass Hemin eine Form der Ferroptose induziert, die 5-LOX-abhängig ist und mit mitochondrialen Schäden verbunden ist, welche jedoch nicht ursächlich für den oxidativen Tod sind. Erastin hingegen induziert eine 5- und 12/15-LOX-abhängige Form der Ferroptose mit hauptsächlicher Beteiligung der Mitochondrien, da MitoQ und Metformin wirksam waren. Die Hemintoxizität unterscheidet sich somit von der Erastin-induzierten Ferroptose. Abschließend wurden in dieser Studie neuartige Selenverbindungen auf ihre Wirksamkeit gegen Ferroptose in HT22-Zellen untersucht. Diese Verbindungen stellen Modifikationen der bereits bekannten GPx4-nachahmenden Verbindung Ebselen dar. Die selenhaltigen Verbindungen zeigten eine bemerkenswert potente Wirkung gegen Ferroptose, die 15–20 Mal niedrigere Konzentrationen für den Schutz benötigten im Vergleich zum Ebselen. Die Selenverbindungen verhinderten die Lipidperoxidation und die ROS-Produktion auf zytosolischer und mitochondrialer Ebene. Zusätzlich wiesen sie starke antioxidative Eigenschaften auf, da die Glutathionspiegel aufrechterhalten werden konnten und eine der Verbindungen sogar die GPx4-Proteinexpression erhöhte. Es konnte auch festgestellt werden, dass die Diselenide wirksamer sind und einem ansteigenden Ferroptosestimulus länger standhalten können im Vergleich zu den Benzisoselenazolen. Es wurden auch Unterschiede in der Wirksamkeit zwischen Erastin- oder RSL3 identifiziert, wobei niedrigere Konzentrationen für die Erastin-induzierte Schädigung ausreichten. Die Anwendung bis zu 8 Stunden nach dem Ferroptosestimulus war immer noch ausreichend, um die Zellintegrität zu bewahren. Diese vielversprechenden in vitro-Ergebnisse charakterisieren die neuen Verbindungen als potente Substanzen gegen Ferroptose, was weitere Untersuchungen rechtfertigt, um Aufschluss über die Wirksamkeit der Selenverbindungen in vivo zu erhalten.