Time-resolved crystallography on the structural dynamics of cryptochromes and photolyases

Photolyasen und Cryptochrome bilden eine Superfamilie (PCSf) von lichtgesteuerten Proteinen, die in allen Bereichen des Lebens vorkommen. Photolyasen reparieren UV-induzierte DNA-Läsionen, nämlich entweder Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere (CPD) oder Pyrimidin-(6-4)-Pyrimidon-Photoprodukte, (6-4)PP. Die Cryptochrome haben größtenteils ihre DNA-Reparaturfunktionalität verloren und fungieren als Signalproteine, die verschiedene biologische Reaktionen auf Lichteinfall koppeln. Photolyasen und Cryptochrome haben enge evolutionäre Beziehungen und teilen beide eine gemeinsame Topologie, einschließlich der gleichen photoaktiven Regionen (FAD, Antennen-Cofaktoren). Während der Photoaktivierung kann FAD ein oder zwei Elektronen einfangen und in vier möglichen Redoxzuständen existieren: oxidiert (FADox), anionisches Semichinon-FAD-Radikal (FAD•−), radikalisch halbreduziert (Semichinon, FADH•) und vollständig reduziert (Hydrochinon, FADH−). Blaulichtabsorption führt zum ersten Elektronentransfer zum inaktiven FADox Chromophor, was zur kurzlebigen FAD•− Spezies führt, ein Zwischenprodukt zum langlebigen protonierten FADH• Zustand ist. Ein zweiter Elektronentransfer bildet den vollständig photoaktivierten Zustand, FADH−, aus, der die DNA-Reparatur von CPD oder (6-4)PP Schäden katalysiert, indem ein Elektron vom angeregten FADH−* auf die DNA-Läsion injiziert wird. Die vorliegende Studie konzentriert sich auf die strukturellen Veränderungen mittels zeitaufgelöster serieller Femtosekunden-Röntgenkristallographie (TR-SFX), um zu beschreiben, wie Cryptochrome den Signalübertragungsmechanismus im tierähnlichen Cryptochrom aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii (CraCRY) durchführen. CraCRY ist nicht nur ein Cryptochrom, sondern hat auch eine (6-4)-Photolyase-Funktion, d.h. ist zur Reparatur von (6-4)PP-Schäden. In CraCRY fungieren während des ersten lichtgesteuerten Zyklus drei Tryptophanreste und ein Tyrosin (Y373) als Elektronentransferkette, wobei Y373 das Elektron an das FAD abgibt, um das kurzlebige Radikalpaar (RP) FAD•−/Y373•+ zu erzeugen, das sich zum langlebigen FADH•/Y373• RP durch Protonierung stabilisiert. Das Tyrosyl-Radikal löst eine Strukturänderung in der Region zwischen der Schleife, die den Tyrosyl-Radikal trägt, und der C-terminalen α22-Helix aus, was zur anschließenden Entfaltung des C-Terminus führt. Während der Photoreduktion von CraCRY wurden 19 Schnappschussstrukturen durch TR-SFX erhalten, die zeigten, dass die Signaltransduktion in drei verschiedene Phasen vom ns- bis ms-Bereich erfolgte: (1) Stabilisierung des FAD•− und Tyr•+-Biradikals (ns), (2) Stabilisierung von FAD•− über Protonentransfer (μs zu ms) und (3) C-terminale Entfaltung (ms zu s). Diese Ergebnisse zeigten erstmals einen detaillierten molekularen Mechanismus für die Cryptochrom-Photoaktivierung. Für die (6-4)PP-Reparatur gelang es, den Prozess via in-crystallo Cryo-Trapping von Post-Illuminations-Zwischenprodukten vorläufig zu charakterisieren. Wir waren in der Lage, drei Stadien der komplexen Dissoziation mit atomarer Auflösung zu bestimmen: (1) Basenrelaxation innerhalb des aktiven Zentrums, (2) Basenrückkehr in Richtung der ungepaarten DNA-bubble und (3) DNA-Freisetzung aus dem aktiven Zentrum der (6-4)-Photolyase. Zur weiteren Untersuchung der Photoreduktion wurden Mutanten jedes relevanten Akteurs im Signalzustand sowohl spektroskopisch als auch kristallographisch charakterisiert. Diese Mutationen beeinflussten die Ausbildung des Signalzustands, wodurch die Rolle einzelner Aminosäuren während des CraCRY-Photozyklus charakterisiert wurde. Gegenwärtig ist der Reparaturmechanismus für die Reparatur von (6-4)PP DNA-Läsionen noch unklar. Zukünftige TR-SFX-Experimente werden in der Lage sein den gesamten Reparaturmechanismus für die (6-4)PP-Reparatur zeigen.