Engineering Enzymes and Pathways for Alternative CO2 Fixation and Glyoxylate Assimilation

Der CBB-Zyklus ist der verbreiteste CO2 Fixierungsweg, der in vielen photoautotrophen Organismen, z. B. Cyanobakterien, vorkommt. Der CBB-Zyklus sowie sein Schlusselenzym RuBisCO entwickelten sich allerdings in einer Atmosphäre, die hauptsächlich CO2 und nur wenig O2 enthielt. Mit dem Aufkommen der oxygenen Photosynthese und der Sauerstoffanreicherung der Atmosphare wurde RuBisCO zunehmend ineffizienter. Da dieses Enzym nur bedingt zwischen CO2 und O2 unterscheiden kann, entwickelten Organismen mit diesem Stoffwechsel sogennante Kohlendioxidonzentrationsmechanismen (engl. CCMs) und Photorespiration. Letztere ist ein Stoffwechselweg zur Entfernung des toxischen Nebenprodukts der OxygenaseReaktion, 2-Phosphoglykolat (2PG), mit dem Ziel es als verwertbare Metaboliten zurück zu gewinnen. Bei der klassischen Photorespiration wurde mindestens ein CO2 für zwei Molekule 2PG freigesetzt, was die Produktion von Biomasse deutlich reduziert. In dieser Arbeit werden zwei Beispiele fur die verschiedenen Ansätze zur Lösung dieses Problems diskutiert. In zwei Kapiteln wird die synthetische Photorespiration anhand des von der Natur inspirierten 3-Hydroxypropionat (3OHP) Bypass (eng. 3OHP bypass) behandelt. Synthetische CO2-Fixierung wird in einem Kapitel uber die Substratselektivitat eines Enzyms des kürzlich publizierten CETCH Zyklus behandelt. Photosynthetische Organismen recyceln photorespiratorisches 2PG nicht immer vollstandig, sondern dephosphorylieren es auch zu Glyoxylat und geben es an die Umgebung ab. Andere Bakterien, wie das thermophile Bakterium C. aurantiacus, können diese Säuren aufnehmen und haben einen Stoffwechselweg, den 3OHP-Bi-Zyklus, um sie ohne CO2 Verlust zu verstoffwechseln. Diese Erkenntnis inspirierte die Entwicklung eines synthetischen, carboxylierenden Weg der Photorespiration an, die 3OHP Bypass. Der erste Versuch diesen Weg in das Cyanobakterium S. elongatus einzufuhren, wurde von Shih et al. durchgeführt. In Kapitel 3 werden die fortgesetzten Bemuhungen zur Verbesserung des 3OHP Umweges in S. elongatus beschrieben. Es beschreibt ein verbessertes Selektionsschema, das auf einem Carboxysomen-Knockout-Stamm und der Gegenselektion von Propionat, als Wachstumshemmer beruht. Ein Teil des 3OHP Umweges konnte damit in einem Bioreaktor im Turbidostatmodus durch Selektion auf das schnellste Wachstum evolviert werden. Der Stamm mit initial hohem CO2 Bedarf erhohte seine Toleranz innerhalb von 125 Tagen von 0.5% auf 0.2 % CO2. Zu den Enzymen des 3OHP-Bi-Zyklus gehoren Katalysatoren mit einzigartigen Ei- ¨ genschaften, wie die intramolekulare CoA-Transferase, Mesaconyl-C1-C4-CoA CoATransferase (Mct). Das Kapitel 4 widmet sich der Strukturanalyse dieses Enzyms und der einzigartigen Selektivität auf den intramolekularen Transfer. Mct hat ein sterisch eingeschranktes aktives Zentrum, das durch den CoA-Teil von Mesaconyl-CoA für externe Säuren versperrt wird. Eine Proteinstruktur mit gebundenen Intermediaten und die Kinetik mit externen Säuren unterstützen diese Behauptung. In Kapitel 2 wird die unspezifische Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase (SucD) die im hier ebenfalls beschriebenen synthetischen CO2-Fixierungswegen CETCH vorkommt behandelt. Das Enzyme SucD aus C. kluyveri ist unspezifisch gegenuber anderen CoA-Estern, insbesondere gegenuber Mesaconyl-C1-CoA, einem weiteren Intermediat des CETCH Zyklus. Die Nebenreaktion entfernt Mesaconyl-C1-CoA aus dem Kreislauf und beeinträchtigt damit seine Funktion. Die Spezifizität wurde durch die Lösung der Kristallstruktur von CkSucD und die Schließung des aktiven Zentrums erhöht. Dazu wurde ein Lysin im aktiven Zentrum durch Arginin ersetzt. Die Mutation verringerte die Aktivitat von 16% auf 2%, aber die Gesamteffizienz nahm ab. Bei einem Homolog aus C. difficile hatte diese Mutation eine vergleichbare Wirkung, indem sie die Nebenreaktion von 12% auf 2% senkt ohne dabei die Effizienz mit Succiny-CoA zu beeinträchtigen. Das entworfene Enzym ist ein brauchbarer Ersatz für zukünftige Iterationen des CETCH-Zyklus.