Characterization of single point mutation in the gamma-carboxyglutamic acid domain of recombinant clotting Factor IX and its therapeutic potential

Hämophilie B (HB) ist eine vererbte Blutungsstörung, die durch einen Mangel an dem Gerinnungsfaktor IX (FIX) verursacht wird. Der Schweregrad wird auf der Grundlage der FIX-Aktivität im Plasma klassifiziert. Als relevanter Parameter für die Aufrechterhaltung der Hämostase gilt ein Talspiegel der FIX-Aktivität im Blutkreislauf von über 5 %. Obwohl sich rekombinante FIX (rFIX)-Produkte mit verlängerter Halbwertszeit bei der Verringerung der jährlichen Blutungsraten bei HB-Patienten als äußerst effizient erwiesen haben, gibt es ein neues Konzept, wonach zusätzlich zum zirkulierenden FIX auch extravaskuläres (EV) FIX, das nicht im Plasma zirkuliert und daher nicht messbar ist, zur Hämostase beiträgt. Eine einzelne Punktmutation in der Nähe des N-Terminus von rFIX wurde als bestimmend für die Bindung von FIX an den extravaskulären Raum beschrieben, der Endothelzellen und Komponenten der extrazellulären Matrix umfasst. In dieser Arbeit wurde die biologische Bedeutung von rFIX im extravaskulären Raum (EVR) unter Verwendung rFIX-Proteine mit einer Substitution an Position 5 untersucht, von der bekannt ist, dass sie die Bindung an EVR, insbesondere Kollagen IV, entweder verstärkt (rFIXK5R) oder reduziert (rFIXK5A). Eine Albuminfusion verlängert die Halbwertszeit von rFIX und ist ein Standard für die prophylaktische Therapie. Um die Auswirkungen der Albuminfusion auf die EV-Verteilung und die hämostatische Wirksamkeit von rFIX zu verstehen, wurden mit Albumin fusionierte und nicht fusionierte rFIX-Protein-K5-Varianten erzeugt und in vitround in vivo untersucht. Eine funktionelle Charakterisierung der rFIX-Varianten wurde in einem einstufigen FIX-Gerinnungstest und in einem modifizierten chromogenen FIX-Aktivitätstest durchgeführt, der den Tenase-Komplex in vitro nachahmt. Das pharmakokinetische (PK) Profil wurde in HB (FIX ko) Mäusen nach intravenöser und subkutaner Verabreichung untersucht. Die Plasmaspiegel der rFIX-Proteine und die immunhistochemische Auswertung der Leberproben bestätigten veröffentlichte Daten, wonach rFIX, welches eine K5A- oder eine K5R-Mutation trägt, einen Einfluss auf das PK-Verhalten und die Sequestrierung im Gewebe hat. Das mit Albumin fusionierte und nicht fusionierte rFIXK5R wurde sowohl bei intravenöser als auch bei subkutaner Verabreichung in niedrigeren Konzentrationen im Plasma gefunden, und es wurde festgestellt, dass rFIXK5R im Gewebe zurückgehalten wird. Dennoch scheint Kollagen IV allein nicht der Bindungspartner im extravaskulären Kompartiment zu sein, wie die Experimente zur Oberflächenplasmaresonanz zeigten. Die Wirksamkeitsstudien deuteten darauf hin, dass die Fähigkeit von FIX, an Komponenten des EVR zu binden, einen Einfluss auf die hämostatische Reaktion in HB-Mausmodellen hat. Anhand von zwei verschiedenen in vivo-Modellen der Hämostase und Thrombose konnten wir zeigen, dass ein mutiertes rFIX-Protein mit verstärkter Bindung an Komponenten des EVR (rFIXK5R) eine verlängerte hämostatische Wirksamkeit verleiht, während die Dauer der Wirksamkeit von rFIXK5A nach intravenöser Verabreichung der rekombinanten Proteine deutlich kürzer war. Diese Ergebnisse lassen sich durch ein zusätzliches lokal zugängliches rFIXK5R am Ort der Verletzung erklären, auch zu späteren Zeitpunkten. Wir konnten nachweisen, dass nach subkutaner Verabreichung nur die Gruppe der rFIXK5A injiziert wurde den Blutverlust im Modell der Schwanzklammerblutung signifikant reduzierte. Die geringere Bindung von rFIXK5A an EVR und die beobachtete größere Plasmaexposition nach subkutaner Verabreichung trugen möglicherweise zur hämostatischen Wirksamkeit bei. Diese Ergebnisse belegen, dass (1) die Aufrechterhaltung eines konstanten Talspiegels von FIX für die Wirksamkeit entscheidend ist und (2) die Modulation der FIX-Bindungseigenschaften an extravaskulärem Gewebe eine wichtige therapeutische Strategie für die subkutane Verabreichung sein kann.