Identification of lead molecules for the development of antivirals targeting the Ebola virus matrix protein VP40

Viren aus dem Genus Ebola-Virus der Familie der Filoviridae verursachen schweres Fieber mit ungewöhnlich hoher Sterblichkeitsrate, und bis heute gibt es keine zugelassenen antiviralen Medikamente. Das virale Matrixprotein VP40 spielt eine wichtige Rolle bei der Knospung neuer Viruspartikel und ist auch an der Regulierung der viralen Genomreplikation und Transkription beteiligt. VP40 existiert in drei verschiedenen homo-oligomeren Formen, nämlich als Dimere, Oktamere und polymere Filamente. VP40-Dimere werden zur Plasmamembran transportiert, wo die Interaktion mit Lipiden die Bildung von VP40-Filamenten auslöst. Filamente stellen eine flexible Reihe von Dimeren dar, die die Knospung von Viruspartikeln ermöglichen und die innere Schicht der neuen Virionen auskleiden. Nach der Bindung von zellulärer RNA verwandeln sich die VP40-Dimere im Cytosol in ringförmige Oktamere, die eine hemmende Wirkung auf die virale RNA-Synthese ausüben. Für die vorliegende Arbeit wurde die Auflösung der Kristallstruktur von VP40 optimiert und ein strukturgesteuertes Wirkstoffdesign mit dem Ziel eingesetzt, die für VP40 essentielle Homo-Oligomerisierung zu beeinträchtigen. In der Studie wurde VP40 der beiden Ebolavirus-Stämme Zaire (zVP40) und Sudan (sVP40) untersucht. Die VP40-Reste L117 und W95 sind sogenannte Hot-Spot-Aminosäuren der dimeren und oktameren Schnittstelle von sVP40, die durch Mutationsanalysen charakterisiert wurden. Wie erwartet bildeten sowohl sVP40 Wildtyp (WT) als auch W95A fast ausschließlich Dimere, während sVP40 L117A bei der Expression in E. coli hauptsächlich Monomere bildete. Überraschenderweise war die Struktur der beiden sVP40-Mutanten jedoch ähnlich wie die von sVP40 WT. Da die monomere sVP40 L117A eine dimere Kristallpackung aufwies, wurden kristallografische Artefakte in Betracht gezogen, was die Strukturanalyse der Mutanten in Lösung zur Folge hatte. Mit Hilfe der Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie und der thermischen Verschiebung konnte gezeigt werden, dass beide Mutanten in Lösung eine erhöhte Flexibilität und eine verringerte Stabilität aufweisen. Zudem konnte bestätigt werden, dass sVP40 L117A tatsächlich ein Monomer ist. In cellulo war die Fähigkeit von sVP40 L117A virusähnliche Partikel (VLPs) zu bilden und die virale Genomreplikation und -transkription zu hemmen, fast vollständig aufgehoben, während sVP40 W95A einen Funktionsgewinn zeigte, da dieses Protein mehr VP40-VLPs in den Zellüberstand freisetzte und auch eine stärkere Hemmung der viralen RNA-Synthese zeigte. Diese Daten deuten darauf hin, dass die gezielte Homo-Oligomerisierung eine vielversprechende Strategie zur Beeinträchtigung der VP40-Funktionalität ist, die jedoch interdisziplinäre Methoden erfordert, insbesondere hinsichtlich der Strukturbestimmung. Basierend auf einer hochauflösenden Kristallstruktur von dimerischem sVP40 WT konnte die Struktur des C-Terminus von sVP40 analysiert werden. Der C-Terminus enthält die einzigen beiden Cysteine des Moleküls, die im Kristall eine Disulfidbrücke bilden. Wenn VP40 in Säugetierzellen exprimiert und in den Überstand freigesetzt wurde, wurden die Cysteine auch durch posttranslationale Modifikationen wie Glutathionylierung und Nitrosylierung oxidiert. In vitro konnte VP40 durch humanes Thioredoxin wiederum reduziert werden. Während die Gesamtstruktur und der oligomere Zustand von sVP40 erhalten blieben, führte die Mutation der Cysteine zu veränderten Phänotypen im Hinblick auf die Fähigkeit von VP40, die virale RNA-Synthese zu regulieren und die Knospung und Partikelbildung zu induzieren. In einem Versuch, die Homo-Oligomerisierung direkt zu unterbrechen, wurden Peptide, die die Aminosäuresequenz der verschiedenen Schnittstellen nachahmen, entwickelt und sowohl in funktionellen als auch in biochemischen Versuchen getestet. Obwohl ihre Bindung an VP40 gezeigt werden konnte, waren die Peptide nicht in der Lage, die Funktionen oder die Selbstorganisation von VP40 zu beeinflussen. Darüber hinaus sollte die dimere Schnittstelle von VP40 mit kleinen Molekülen angegangen werden. Zu diesem Zweck wurde das Disulfid-Tethering als alternativer Ansatz unter Verwendung einer sVP40-Variante mit einem durch Mutagenese eingefügten Cysteinrest in der Nähe der dimeren Schnittstelle (N67C) etabliert. Diese Methode nutzt die Bildung einer kovalenten Disulfidbrücke zwischen dem eingeführten Cystein und thiolhaltigen Fragmenten. Nach der Inkubation unter reduzierenden Bedingungen wurden nur Fragmente mit zusätzlichen Wechselwirkungen zu VP40 positiv gebunden und konnten mittels Massenspektrometrie des intakten Proteins nachgewiesen werden, wobei sich mehrere Fragmenttreffer ergaben. Obwohl keine strukturellen Informationen über einen der sVP40 N67C-Fragmentkomplexe vorlagen, um den Bindungsmodus und den Bindungsort zu bestimmen, erwies sich diese Strategie als äußerst erfolgreich bei der Identifizierung vielversprechender leitstrukturähnlicher Moleküle. Mit Hilfe einer Bibliothek von 96 vorselektierten Fragmenten wurde Salicylsäure (SA) mittels crystal soaking als kristallographischer Binder von VP40 identifiziert. Die Bindung an VP40 konnte in Lösung bestätigt werden. Die schwache Bindung hatte erwartungsgemäß nur geringe Auswirkungen auf die Funktion von VP40 bei der RNA-Synthese und beim Budding. Die Charakterisierung von VP40-Resten, die an der Interaktion mit SA beteiligt sind (L158 und R214), deutete darauf hin, dass die Bindungstasche zwischen der N- und der C-terminalen Domäne ein sehr empfindlicher Zielort ist, da die Mutation dieser Reste zu einer verminderten Fähigkeit zur Regulierung der viralen Genomreplikation und Transkription für sVP40 R214A sowie zu einer verminderten Knospung sowohl für sVP40 L158A als auch R214A führte. Dies veranlasste das Testen von SA-Derivaten und die Identifizierung von vier weiteren kristallographischen Liganden (3-Amino-SA, 4-Fluor-SA, 4-Fluor-2-Hydroxybenzamid und 5-Amino-SA). Ein weiterer strukturgeführter Wirkstoffentwurf führte zur Entwicklung, Synthese und Prüfung von LL060, einer Verbindung, die erstmals die Bildung von VP40-VLPs beeinträchtigen konnte. Zusammenfassend wird das strukturbasierte Verfahren zur Entwicklung von Arzneimitteln von Grund auf beschrieben, das auf die Funktion des Ebola-Virus VP40 abzielt. Die Homo-Oligomerisierung von VP40 wurde als vielversprechendes Ziel charakterisiert und validiert und mehrere Leitmoleküle identifiziert, die aus zwei verschiedenen Liganden-Screenings hervorgingen. Die vielversprechende Leitverbindung LL060, die durch crystal soaking entwickelt wurde, bildet den Ausgangspunkt für die Entwicklung eines Ebola-Virus-Inhibitors.