Analysis of chromosome segregation and its coordination with cell division in alphaproteobacteria

Chromosomenreplikation und -segregation sowie deren Koordination sind für die Fortpflanzung von Lebewesen unabdingbar. In Bakterien wurde dieser Prozess bisher in morphologisch simplen und bereits etablierten Modellorganismen untersucht. In dieser Arbeit erweitern wir das bekannte Wissen um die Chromosomenreplikation, Zellteilung und deren Koordination in alpha Proteobakterien. Hierfür wurden zwei Modellorganismen zur Untersuchung verwendet, das gestielte, sich über Knospung vermehrende Bakterium Hyphomonas neptunium und der bereits gut untersuchte Modellorganismus Caulobacter crescentus. Beide Bakterien besitzen einen einzigartigen Zellzyklus, in dem sich begeißelte Schwärmerzellen, welche teilungsunfähig sind, in teilungsfähige gestielte Zellen entwickeln. Im Falle der Hantelförmigen Spezies H. neptunium, wird die neue Zelle mittels Knospung am Distal-Ende des Stiels gebildet. Dadurch ist die Translokation einer Kopie des Chromosoms, durch den Stiel in die zukünftige Tochterzelle nötig. Dies geschieht durch einen einzigartigen, zwei teiligen Prozess, der an die eukaryotische Zellteilung erinnert. Der erste Teil dieses Prozesses, die Segregation des Chromosoms in der Mutterzelle, geschieht in Abhängigkeit des ParABS DNA-Segregationssystems, ähnlich wie im nah verwandten Bakterium C. crescentus. Der duplizierte Ursprung verbleibt vorerst am gestielten Pol und wird später im zweiten Teil dieses Prozesses, ausgelöst durch einen unbekannten Faktor, durch den Stiel segregiert. In dieser Arbeit haben wir systematisch die Dynamik der Chromosomenreplikation in H. neptunium, sowie deren Koordination mit der Segregation des Chromosoms durch den Stiel analysiert. Wir haben herausgefunden, dass bereits mehr als die Hälfte des Chromosoms verdoppelt wurde, bevor der zweite Schritt der Segregation initiiert wird. Diese Studie zeigt mehrere Fragen auf, wie zum Beispiel nach dem Grund hinter der Pause der zweitteiligen Segregation, nach potentiellen beteiligten Faktoren sowie den Mechanismen welcher in die Koordination dieser zwei Schritte involviert ist. H. neptunium besitzt mehrere ParA Homologe. Da bekannt ist, dass die DNA segregierende ATPase ParA und ParA-ähnliche Proteine involviert in Chromosomensegregation sind, haben wir das neuartige potentiell in die Koordination der DNA-Segregation involvierte ParA-ähnliche Protein HNE_0708 untersucht. Interessanter Weise haben wir in dieser Arbeit herausgefunden, dass dieses Protein zu einer separaten Untergruppe der ParA-ähnlichen Proteine gehört. Ebenfalls interessant ist das Vorhandensein einer TIR-Domäne, welche dafür bekannt ist in Protein- Protein Interaktionen involviert zu sein. Ähnlich wie ParA zeigt dieses Homolog ATPase- Aktivität und bindet unspezifisch an DNA. Davon abgesehen führt die Abwesenheit dieses Proteins zu einem charakteristischen Phänotyp, mit ausgestülptem Stiel und einem Defekt in Chromosomensegregation und -replikation. Daher koordiniert HNE_0708 potentiell Zellmorphogenese durch Chromosomenreplikation, -segregation und potentiell auch Zellteilung. Als ausgezeichnetes Beispiel für ein System, welches Zellteilung und Chromosomensegregation in Alpha-Proteobakterien koordiniert, wurde im Weiteren der gut etablierte Modellorganismus C. crescentus untersucht. Das DNA-Segregation-Protein ParB von C.crescentus interagiert einerseits mit dem kanonischen ParA, um die Chromosomensegregation herbeizuführen und andererseits mit dem ParA-ähnlichen Protein MipZ um die Positionierung der Teilungsebene zu definieren. Dadurch koordiniert ParB sowohl die Chromosomensegregation als auch die Zellteilung. Die Interaktion zwischen ParB und MipZ ist von zentraler Bedeutung für die Platzierung der Teilungsebene der Zelle, da durch die Interaktion primär die Dimerisierung des MipZ-Monomers angeregt wird, welche effektiv die Bildung des zytokinetischen FtsZ-Ringes in dessen Nähe blockiert. In dieser Studie wurde diese Interaktion systematisch mittels biochemischer Methoden analysiert. Wir haben herausgefunden, dass die C-terminale Domäne von ParB- Dimeren mit der C-terminalen Region von MipZ, sowohl in der monomeren als auch in der dimeren Form interagiert. Durch eine Reihe von biochemischen Experimenten konnten wir ebenfalls schlussfolgern, dass die C-terminale Region von ParB notwendig und auch ausreichend für die Interaktion mit MipZ in vitro ist. Durch diese Experimenten konnten wir diese Interaktion, durch die Konstruktion von ParB-Chimären sowie der Verwendung eines C-terminalen ParB-Fragments testen, was zur in vitro Rekrutierung von MipZ führte. Zusammenfassend erweitern diese neuen Erkenntnisse das Wissen über die Interaktion zwischen der Zellteilung und der komplexen Maschinerie, die Bakterien entwickelt haben um Chromosomensegregation zu regulieren und koordinieren.