Identification and characterization of two radical SAM enzymes involved in biosynthesis of the [Fe]-hydrogenase cofactor

Die meisten methanogenen Archaeen reduzieren CO2 mit Hilfe von Wasserstoff (H2) zu Methan. Für diese Aufgabe verwenden sie spezielle Metalloenzyme, die Hydrogenasen. Die Expression der [Fe] Hydrogenase (Hmd) wird dabei unter Nickel-limitierten Wachstumsbedingungen erhöht. Hmd katalysiert die Reduktion von Methenyl-H4MPT+ zu Methylene-H4MPT mittels Transfer eines Hydrids von H2. Im aktiven Zentrum des Enzyms befindet sich ein einzigartiger Kofaktor, der FeGP Kofaktor, der aus einem Eisenzentrum, einem Pyridinol und einer GMP-Gruppe aufgebaut ist. Das Eisen wird von zwei Kohlenmonoxidliganden, Schwefel eines Cysteines, dem Stickstoff und der Acylgruppe des Pyridinols koordiniert. Für die Biosynthese dieses Kofaktors sind mindestens sieben Gene erforderlich, die hmd co-occurring genes (hcgA-G) genannt werden. HcgC ist eine SAM abhängige Methyltransferase, die die dritte Position des Vorläufermoleküls 1 (6 Carboxymethyl-4-hydroxyl-2-pyridinol) methyliert und das Vorläufermolekül 2 bildet. Dieser wird von HcgB guanylyliert und daraus entsteht Verbindung 3 oder auch genannt GP. Das ATP abhängige Enzym HcgE aktiviert die Carbonsäuregruppe mittels Adenylylierung. Zusätzlich wurde eine anschließende Bildung eines Thioester mit einem Cystein von HcgF angenommen. Die Funktion von HcgD konnte noch nicht abschließend geklärt werden, aber die Kristallstruktur weist auf eine Funktion im Eisentransport hin. In dieser Arbeit konnte ich die Funktion der beiden anderen Proteine HcgA und HcgG aufklären. Ich habe das hcgA Gen in Escherichia coli produziert und das aktive Protein aufgereinigt. Mit Hilfe eines neu entwickelten in vitro Biosyntheseassay (Schaupp und Arriaza et al. 2022. Angew. Chem. Int. Ed. 61, e202200994) habe ich gezeigt, dass HcgA ein radikalbildendes SAM-abhängiges Enzym ist, welches das Vorläufermolekül 1 bildet. Da HcgG bei der Produktion in E. coli Einschlusskörper bildet habe ich das Protein in Methanococcus maripaludis produziert und konnte so aktives Protein aufreinigen. In vitro Biosyntheseexperimente zeigen, dass HcgG ebenfalls ein radikalbildendes SAM-abhängiges Enzym ist. Diese Experimente weisen darauf hin, dass HcgG erstens CO aus einer unbekannten, zellulären Substanz synthetisiert, zweitens während der Biosynthese die CO Liganden aus gasförmigen CO formen kann, drittens die Acylgruppe bildet und viertens den FeGP Kofaktor assembliert inklusive dem Einbau des Fe2+ Ions. Neben der Untersuchung der Biosynthese habe ich in vitro die Aktivierung des Holoenyzmes der [Fe] Hydrogenase kinetisch untersucht und einen Mechanismus vorgeschlagen. Weiterhin habe ich die Funktion des Hmd paralogs (HmdII) mittels Mutationsanalyse untersucht und konnte zeigen, dass HmdII die [Fe] Hydrogenaseaktivität negativ reguliert ohne die Produktion des Hmd Proteins zu beeinflussen.