In Vitro Biosynthesis of the FeGP Cofactor of the [Fe]-Hydrogenase

Das Leben benötigt unterschiedlichste, komplexe, chemische Reaktionen, die zum Großteil nur durch das Zusammenspiel von Metallkofaktoren und Enzymen erreichbar sind. Ein Beispiel ist die Spaltung von Wasserstoff (H2) durch Hydrogenasen, die nach der Metallzusammensetzung ihrer Kofaktoren als [NiFe]-, [FeFe]- oder [Fe]-Hydrogenasen klassifiziert werden. In meiner Doktorarbeit habe ich die Biosynthesynthese des Kofaktor der [Fe] Hydrogenase untersucht, der auch Eisenguanylylpyridinol (FeGP) genannt wird. Er besteht aus einem Eisenatom, das von zwei Kohlenstoffmonoxid (CO) Liganden, dem Schwefel eines Cysteins und einem Acylmethylenepyridinol komplexiert wird. Es wird angenommen, dass die Proteine HcgA G für die Biosynthese zuständig sind, wobei HcgB F bereits teilweise strukturell und funktional untersucht wurden. Um diese Ergebnisse zu bestätigen, die Funktion von HcgA und HcgG aufzuklären und die Bildung des Acyl- und der CO-Liganden zu analysieren, habe ich einen in vitro Biosyntheseassay entwickelt. Diese Strategie wurde auch für die Untersuchung der Biosynthese der Metallkofaktoren der [FeFe]-Hydrogenase und der Nitrogenase verwendet. Der entwickelte Assay ermöglicht die Aktivierung der [Fe] Hydrogenase Apoenzyms durch Zugabe eines Vorläufermoleküls 6 Carboxyl-methylene-3,5-dimethyl-4-guanylyl-2-pyridinol (3), chemischen Substraten und des Zellextrakts von ∆hcg Mutanten des Archaeons Methanococcus maripaludis. Dabei bestätigten die Ergebnisse aus den Experimenten mit der ∆hcgB∆hcgC Mutante die Identität des Kofaktorvorläufermoleküls 3. Insbesondere die Präsenz einer Carboxylgruppe konnte gezeigt werden, die in einem der folgenden Schritte zum Acylliganden des Kofaktors reduziert wird. Um mehr über die Biosynthesereaktionen herauszufinden habe ich mittels der in vitro Biosynthese und anderer biochemischer Methoden untersucht, welche Substrate für die Reaktionen notwendig sind. Hier habe ich gezeigt, dass die in vitro Biosynthese ATP abhängig ist. Außerdem benötigt der in vitro Biosyntheseassay Reduktionsequivalente, die aus Wasserstoff oder Formiat erzeugt wurden. Weiterhin wurde während der in vitro Biosynthese gasförmiges CO in die CO Liganden des Kofaktors eingebaut. Durch die Verwendung von verschiedenen Mutanten für die Zellextrakterzeugung, habe ich gezeigt, dass die vorgeschlagene Reaktionsfolge von HcgB und HcgC korrekt ist, sowie das HcgF für die in vitro Biosynthese vermutlich nicht notwendig ist. Außerdem habe ich die Bildung eines vorgeschlagenen AMP 3 Zwischenproduktes in der HcgE Reaktion durch eine gekoppelte, chemische Reduktion bestätigt und dass Molekül 3 an HcgF bindet. Die Funktion von HcgA, die Bildung des ersten Kofaktorvorläufermoleküls (1), und HcgG, die Umwandlung von Molekül 3 in den FeGP-Kofaktor, wurden außerdem aufgeklärt (Dissertation, F. Arriaza). Wir haben auch erste Erkenntnisse zur in vitro Biosynthese des FeGP Kofaktors mit reinen Hcg Proteinen und dem Filtrat des Zellextrakts von M. maripaludis gewonnen, wobei diese Experimente bisher nicht reproduziert werden konnten.