Chromosomal Architecture and its Influence on Gene Expression in Native and Engineered Bacteria

Die Forschung der letzten Jahre hat neue Erkenntnisse über den Einfluss der chromosomalen Architektur auf die bakterielle Genregulation und -expression erbracht. Auf der topologischen Ebene kann die Chromosomenkompaktierung weit voneinander entfernte Gene oder Regionen in räumliche Nähe bringen, was auf ein Regulierungskonzept der Koexpression entfernter Gene hindeutet. DNA-Supercoiling, das hochdynamisch und einer der Hauptfaktoren bei der Nukleoidbildung ist, kann die Genexpression durch modulierende Effekte auf die Transkription erheblich beeinflussen. Außerdem erhöht der durch die Replikation hervorgerufene Kopienzahl-Effekt die Expression von Genen, indem er die Anzahl der Genkopien während der Replikation vorübergehend erhöht. Wie sich dies auf den Organismus auf einer systemischen Ebene (globale Genexpression) auswirkt, wurde jedoch noch nicht untersucht. In dieser Arbeit wurde der Einfluss des Kopienzahl-Effekts auf die Genexpression in Escherichia coli untersucht. Frühere Publikationen haben gezeigt, dass Gene, die näher am Replikationsursprung (oriC) liegen, in der exponentiellen Phase stärker exprimiert werden als in der stationären Phase. Dieser Effekt nimmt mit zunehmender Entfernung zum Replikationsursprung ab. Im Zuge dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass dieses Expressionsmuster auf den Kopienzahl-Effekt zurückzuführen ist und nicht auf die strategische Positionierung von Genen, die durch globale Transkriptionsfaktoren reguliert werden. Darüber hinaus wurde der regulatorische Einfluss des Kopienzahl-Effekts für einzelne Gene bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass etwa 40% der Gene überwiegend über die Kopienzahl reguliert sind, was auf eine wichtige Rolle des Kopienzahl-Effekts für die Genregulation und -expression in E. coli hinweist. Darüber hinaus wurde der Einfluss des Kopienzahl-Effekts auf die Chromosomenorganisation untersucht. Die Konservierung der Position von Genen relativ zum Replikationsursprung deutet auf einen starken Einfluss des Kopienzahl-Effekts auf die bakterielle Chromosomenevolution hin, insbesondere bei schnell wachsenden Bakterien. Darüber hinaus wurde ein auf CRISPR/Cas9 basierendes Genome Editing Tool (CRISPR SWAPnDROP) etabliert, das für die erforderlichen chromosomalen Veränderungen dieser Untersuchungen benötigt wurde. Dieses Tool wurde außerdem entwickelt, um große chromosomale Veränderungen und den Transfer von chromosomalen Regionen zwischen Bakterienarten zu ermöglichen. Als "proof of principle" wurde eine 151kb große chromosomale Region sowohl zwischen zwei E. coli-Stämmen als auch von E. coli auf das biotechnologisch relevante Bakterium Vibrio natriegens übertragen. Zusätzlich wurde das RP4-Konjugationssystem von E. coli sowohl auf V. natriegens als auch auf das Pflanzenpathogen Dickeya dadantii übertragen und seine Funktionalität in diesen Organismen nachgewiesen. Abschließend konnten mit der Übertragung des lac-Operons von E. coli auf V. natriegens und der Übertragung des GanB ORFs von D. dadantii auf E. coli erfolgreiche "gain of function" Genomeditierungen gezeigt werden.