Proteolytic activation of Zaire ebolavirus and SARS-CoV-2 class I membrane fusion proteins by different host cell proteases

Die proteolytische Prozessierung viraler Fusionsproteine durch Wirtszellproteasen ist eine Voraussetzung für die Replikation und Infektiosität umhüllter Viren. Die Identifizierung der Proteasen, die an der Aktivierung beteiligt sind, ist daher ein wichtiger Schritt zur Entwicklung von Wirtszellproteaseinhibitoren als antivirale Strategien. In dieser Studie sollten die proteolytischen Aktivierungsmechanismen der Klasse I Fusionsproteine des Zaire-Ebolavirus (ZEBOV) und des neuartigen schweren akuten respiratorischen Syndrom (SARS) Coronavirus (CoV) 2 untersucht werden. Beide Viren werden durch die proteolytische Spaltung an zwei Stellen innerhalb des Fusionsproteins aktiviert. Das Fusionsprotein S des neuen SARS-CoV-2 besitzt zwei unterschiedliche Spaltstellen, mit einem multibasischen Motiv an der S1/S2 Stelle und einem monobasischen Motiv an der S2' Stelle. Co-Expression in 293F Zellen sowie Infektionsstudien in Calu-3 Zellen in An- und Abwesenheit von Proteaseinhibitoren zeigten die proteolytische Aktivierung durch Furin und die transmembrane Serinprotease 2 (TMPRSS2). Beide Proteasen erwiesen sich als essenziell für eine effiziente Replikation von SARS-CoV-2, da sie sich nicht gegenseitig kompensieren konnten. Im Gegensatz dazu zeigten In-vitro-Experimente einen hochkomplexen Prozessierungsmechanismus für das ZEBOV GP jenseits der beschriebenen klassischen proteolytischen Aktivierung durch Furin und endosomales Cathepsin B und L. Es wurde gezeigt, dass die zuvor als „nicht spaltbar“ bezeichnete ZEBOV GP_AGTAA Furin-Spaltstellenmutante durch TMPRSS2 und Cathepsin L an bisher unbekannten Positionen in das 20 kDa fusionskompetente GP2 gespalten werden konnte. Darüber hinaus zeigten rVSV∆G ZEBOV GP Pseudovirus-Wachstumskinetiken und Eintrittsstudien mit transkriptions- und replikatioskompetenten Virus-ähnlichen Partikeln (trVLPs) in Huh-7-, VeroE6- und Vero-TMPRSS2-Zellen in An- und Abwesenheit von Proteaseinhibitoren, dass die Proteaseabhängigkeit von ZEBOV GP je nach Proteaserepertoire der jeweiligen Zelllinie variieren kann. Endosomale Cathepsine waren hierbei essenziell für den Eintritt von ZEBOV GP in Huh-7 Zellen und eine kombinierte Behandlung mit Inhibitoren gegen Furin (MI-1148), endosomale Cathepsine (E64d) oder TMPRSS2 (BAPA oder MI-432) war in der Lage, die rVSV∆G ZEBOV GP Replikation vollständig zu inhibieren. Dies war im Gegensatz dazu bei VeroE6- und Vero-TMPRSS2 Zellen nicht der Fall, was darauf hindeutet, dass ZEBOV GP in der Lage ist, andere bisher unbekannte Protease(n) für die proteolytische Prozessierung zu verwenden. Die Spaltung durch Wirtszellproteasen scheint ein wesentlicher Mechanismus für die ZEBOV GP Replikation zu sein, da die Erzeugung stark verkürzter GP-Varianten entweder zu noch spaltbarem oder funktionell inaktivem GP führte. Zusätzlich wurde die subzelluläre Lokalisierung der Wirtszellprotease TMPRSS2, die an der Prozessierung der Fusionsproteine vieler respiratorischer Viren, darunter Influenzavirus HA und SARS-CoV-2 S, beteiligt ist, in Huh-7-Zellen analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass TMPRSS2 wie zuvor beschrieben im TGN akkumuliert, darüber hinaus aber auch im ERGIC und zu einem gewissen Grad im Recycling- und spätem Endosomen von TMPRSS2-überexprimierenden Huh-7 Zellen lokalisiert ist.