SAMHD1: HIV-1 restriction, post-translational regulation and function

Trotz großer Anstrengungen zur Entwicklung von Therapien und Impfstrategien gegen das humane Immundefizienz Virus 1 (HIV-1) stellt das Virus nach wie vor eine erhebliche Bedrohung für die globale Gesundheit dar. Um Behandlungen zu verbessern ist ein tieferes Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Wirt und HIV-1 entscheidend. Es sind zahlreiche pro- und antivirale Wirtsfaktoren bekannt, wobei letztere als Restriktionsfaktoren bezeichnet werden. Sterile α motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) ist ein HIV-1 Restriktionsfaktor, der in myeloiden und ruhenden CD4+ T-Zellen aktiv ist. Während HIV-1 Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) für die DNA-Synthese benötigt, begrenzt SAMHD1 mit seiner dNTP-Triphosphohydrolase (dNTPase) Aktivität den zellulären dNTP-Spiegel. Die antivirale Aktivität von SAMHD1 wird durch Dephosphorylierung des Rests T592 reguliert. Die Auswirkungen der T592-Phosphorylierung auf die dNTPase-Aktivität sind jedoch unklar. Es stehen nur wenige myeloide Modelle und genetische Instrumente zur Verfügung, um die Beziehung zwischen der T592-Phosphorylierung von SAMHD1, der antiviralen Restriktion und den enzymatischen Funktionen von SAMHD1 zu untersuchen. Außerdem könnten zusätzliche zelluläre Funktionen von SAMHD1, sowie zusätzliche post-translationale Modifikationen die antivirale Restriktion beeinflussen. Um die technischen Einschränkungen und diese Wissenslücken zu überwinden, haben wir BlaER1-Zellen als neuartiges menschliches Makrophagen-Modell in Kombination mit CRISPR/Cas9 Knock-in (KI) verwendet, um SAMHD1-Mutationen in einem physiologischen Kontext zu untersuchen. Transdifferenzierte BlaER1-Zellen ähneln primären menschlichen Makrophagen und exprimieren aktives dephosphoryliertes SAMHD1, dass die Infektion mit HIV-1-Reporterviren blockiert. Vpx oder CRISPR/Cas9 Knock-out (KO) von SAMHD1 erlaubt wiederum die HIV-1 Replikation. Mithilfe einer von uns entwickelten Pipeline zur CRISPR/Cas9-vermittelter homologen Rekombination, konnten wir homozygote phosphomimetische SAMHD1 T592E- und phosphoablative SAMHD1 T592A KI-Mutationen in den genomischen SAMHD1 Lokus einbringen. Die homozygote T592E Mutation, nicht aber T592A, führt zum Verlust der HIV-1-Restriktion, was die Rolle der Dephosphorylierung von T592 bei der Regulierung der antiviralen Aktivität bestätigt. In Gegensatz dazu ist der dNTP-Spiegel und die Zusammensetzung des dNTP-Pools in den Zellen mit einer T592E KI-Mutation jedoch unbeeinflusst. Dies bestätigt die Rolle der T592-Phospho-Stelle für die antivirale Restriktion in einem endogenen physiologischen Kontext. Da kein Effekt auf die dNTP-Spiegel festgestellt wurde, deutet das darauf hin, dass die Regulierung der antiviralen Aktivität und die der dNTPase von SAMHD1 möglicherweise entkoppelt sind. Um herauszufinden, ob die dNTPase-Aktivität von SAMHD1 zur HIV-1-Restriktion beiträgt, haben wir ein Überexpressionssystem weiterentwickelt, mit dem wir SAMHD1-Mutanten in BlaER1-Makrophagen zuverlässig auf ihr restriktives Potenzial untersuchen können. Dadurch konnten wir dNTPase-defiziente Mutanten identifizieren, die HIV-1 weiterhin inhibieren. Ebenso konnten wir keine von der T592-Phosphoregulation unabhängige SAMHD1-Funktion nachweisen. Neue Ergebnisse deuten darauf hin, dass SAMHD1 R-Loops, tertiären DNA:RNA-Strukturen an Transkriptions-Replikationskonflikten, beeinflusst. Als Modell hierfür, haben wir die Wirkung einer SAMHD1-Depletion auf CRISPR/Cas9-induzierte R-Loops getestet. Wir konnten keine Veränderungen der Effizienz von CRISPR/Cas9 KO und KI feststellen, was aber nicht ausschließt, dass SAMHD1 endogene R-Loops moduliert. Die fehlende experimentelle Korrelation zwischen der dNTPase-Aktivität von SAMHD1, antiviraler Restriktion und T592-Phospho-Status könnte auch auf ein mangelndes Verständnis der Komplexität der Regulation von SAMHD1 zurückzuführen sein. Um ein differenzierteres Bild der Phosphorylierungsstellen zu erhalten, haben wir eine massenspektrometrische Analyse der endogenen SAMHD1-Phosphopeptide in restriktiven und nicht restriktiven myeloiden Zellen durchgeführt. Neben T592 konnten wir eine Reihe von phosphorylierten Resten identifizieren. T21, T25 und S33 schienen keinen Einfluss auf die SAMHD1-Lokalisierung, Expression, T592-Phosphorylierung oder die Replikation von HIV-1 zu haben. Im Gegensatz dazu erwies sich T579 als eine potenzielle Phosphorylierungsstelle, die die HIV-1-Restriktion regulieren könnte. Daher sind weitere Experimente erforderlich, um die Rolle von pT579 zu bestätigen. Wir glauben, dass die hier vorgestellten Zellmodelle und die genetische Methodik hilfreich sein werden, um das Zusammenspiel zwischen HIV-1-Restriktion, post-translationaler Regulierung und zellulären Funktionen von SAMHD1 zu entschlüsseln. Dieses Wissen könnte für die künftige Entwicklung kurativer oder präventiver Strategien gegen HIV-1 von entscheidender Bedeutung sein.