In vivo and in vitro analysis of RNases in Bacillus subtilis

Der RNA-Abbau ist ein Schlüsselprozess bei der Steuerung der Genexpression in Bakterien und wesentlich für die Homöostase der Nukleotidpools in der Zelle. Eine Schlüsselrolle spielt das so genannte RNA-Degradosom, bei dem es sich um einen membranassoziierten Komplex handelt, der Endo- und Exoribunukleasen sowie glykolytische Enzyme und eine DEAD-Box-RNA-Helikase enthält. Es wird angenommen, dass die Endonuklease RNase Y eine zentrale Rolle bei der Bildung des RNA-Degradosoms in Bacillus subtilis spielt, was zur Rekrutierung der RNasen PnpA, RNase J1 und RNase J2, der RNA-Helikase CshA sowie der glykolytischen Enzyme Enolase und Phosphofructokinase führt. RNase Y hat eine Transmembranhelix und ist "quasi" essentiell; sie ist auch für die mRNA-Verarbeitung nach der Transkription erforderlich. RNase Y interagiert auch mit dem so genannten Y-Komplex, bestehend aus YaaT, YlbF und YmcA (RicT, RicF, RicA), der für die RNase Y-vermittelte Verarbeitung von mRNA wichtig ist. Wie RNase Y in zwei verschiedenen Proteinkomplexen arbeiten kann und sowohl beim RNA-Zerfall als auch bei transkriptionsassoziierten Prozessen wirkt, ist unklar. In dieser Arbeit zeige ich, dass das RNA-Degradosom recht dynamisch ist, mit RNase Y, dem glykolytischen Enzym Enolase und den RNA-Helikasen CshA und PnpA als zentralem Teil, der stark auf eine Blockade der Transkription und damit auf den Verlust von mRNA�Substrat reagiert, während RNase J1 und J2 sowie das glykolytische Enzym Phosphofructokinase eine viel schwächere Reaktion zeigen und daher wahrscheinlich eher periphere Komponenten sind. Der Y-Komplex zeigt eindeutig eine Diffusion innerhalb des Zytosols, aber auch die Bildung von membranassoziierten Ansammlungen, die dissoziieren, wenn die Transkription blockiert wird. Das “Single-molecule tracking” (SMT) zeigt, dass der Verlust einer Komponente des Y-Komplexes die Dynamik der anderen Proteine nicht stark beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass der Komplex eher eine flexible Assoziation als eine 1:1:1-Stöchiometrie bildet. Biochemische Analysen deuten darauf hin, dass YaaT eine Membranverankerung für den Y-Komplex bildet, obwohl es auch eine zytosolische, frei diffundierende Fraktion hat. Es wird ein Modell vorgestellt, wonach der Y-Komplex als Adaptor zwischen der nukleoid-assoziierten mRNA-Synthese und der membran�assoziierten Verarbeitung und Degradation fungieren könnte. IV In meiner Dissertation wird auch ein Protokoll für die erfolgreiche Reinigung der membranassoziierten RNase Y vorgestellt, das die Grundlage für die weitere biochemische Charakterisierung des Proteins und für Interaktionsstudien bildet. Ein weiterer wichtiger Prozess, bei dem RNasen eine entscheidende Rolle spielen, ist die DNA-Replikation. Zusätzlich zu den RNA-Primern, die für die Platzierung von Okazaki�Fragmenten notwendig sind, müssen DNA/RNA-Hybride prozessiert und RNA entfernt werden, um die Stabilität der DNA zu gewährleisten. Ein Teil der Arbeit zeigt, dass die Replikationsgabeln von B. subtilis zwei RNasen der "H"-Familie, die DNA-Polymerase A und die Exonuklease ExoR, in vivo eng miteinander verbinden. Die Rekrutierung scheint eher auf der Substratverfügbarkeit als auf spezifischen Protein/Protein-Interaktionen zu beruhen, wobei redundante enzymatische Aktivitäten beteiligt sind.