Innate Immunity to Ebola virus

Das Ebolavirus ist ein RNA-Virus mit negativer Orientierung und gehört zur Familie der Filoviridae. Es kann schwere Krankheiten verursachen und zu hämorrhagischem Fieber und Multiorganversagen führen. Dendritische Zellen und Makrophagen gehören zu den ersten Zielzellen von Ebola und sind eine wichtige Verbindung zwischen angeborener und erlernter Immunität. Infizierte dendritische Zellen sind jedoch nicht mehr in der Lage eine wirksame Immunreaktion auszulösen. Die Virulenz basiert hauptsächlich auf dem Ebola-Protein VP35, einem Interferon-Antagonisten, der der Aktivierung von RNARezeptoren aus der Familie der RIG-I-ähnlichen Rezeptoren entgegenwirkt. Darüber hinaus könnte eine mögliche Veränderung der viralen RNA durch Proteine von Wirtszellen zusätzliche pro-virale Effekte haben, die die Unterdrückung von Interferon unterstützen. ADAR1 ist ein RNA-Editierungsenzym, das doppelsträngige RNA durch Adenosin-zu-Inosin-Editierung modifiziert, was für die Unterscheidung zwischen eigener und fremder RNA wesentlich ist. Die ADAR1-Editierung von viraler RNA wurde für andere RNA-Viren mit negativer Orientierung nachgewiesen, z. B. für das Masernvirus. Dieser wichtige negative Regulator des Interferonweges wird in zwei Isoformen exprimiert: das Interferon-induzierbare p150, das sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern vorkommt, und das konstitutiv exprimierte p110, das auf den Zellkern beschränkt ist. Eine mögliche Adenosin-zu-Inosin-Editierung von Ebolavirus-Genomen wurde kürzlich durch verschiedene Ansätze sowie in Proben von Überlebenden der Ebolavirus-Erkrankung nachgewiesen. Daher scheinen die Prozesse während der frühen angeborenen Immunantwort auf das Ebolavirus entscheidend für den Krankheitsverlauf zu sein. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktionen des angeborenen Immunsystems des Wirts mit dem Ebolavirus zu untersuchen und zu analysieren. Diese Arbeit befasst sich mit der Immun-Erkennung von transkriptions- und replikationskompetenten virusähnlichen Partikeln des Ebolavirus sowie mit der Erkennung von Ebolavirus-RNA durch das Immunsystem in zellbasierten Assays. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Verbindung zu einer veränderten angeborenen Immun-Erkennung untersucht in Abhängigkeit vom Vorhandensein oder Fehlen verschiedener Isoformen von ADAR1. Das transkriptions- und replikationskompetente virusähnliche Partikelsystem ermöglicht die Modellierung des Lebenszyklus von Ebola unter Laborsicherheitsbestimmungen der Stufe 1. Die angeborene Immunantwort wurde durch Messung der Expression des direkten IRF-3-Zielgens ISG54 determiniert. Zwei verschiedene VP35-Mutanten wurden auf ihre interferon-antagonistische Funktion sowie auf ihre Funktion bei der Replikation und Transkription untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Produktion von virus-ähnlichen Partikeln einschließlich der VP35-Mutanten in HEK 293T-Zellen zu einer starken Interferon-β-Antwort im Vergleich zu Wildtyp VP35 führt, was darauf hindeutet, dass die mutierten VP35-Proteine ihre antagonistische Aktivität im Vergleich zu Wildtyp VP35 verloren haben. Dennoch führt die Infektion von Zellen mit mutierten VP35 Partikeln nicht zu einer Immunantwort. Um das Fehlen einer angeborenen Reaktion auf eine Partikel-Infektion weiter zu untersuchen, wurde das immunstimulierende Potenzial nackter Ebolavirus-RNAs, die aus Partikeln isoliert wurden, in einem quantitativen Assay unter Verwendung von aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen und aus Monozyten gewonnenen Makrophagen als Modell für hoch immunkompetente Zellen untersucht. Nach der Transfektion von viralen Nukleinsäuren in immunkompetente Zellen wurde eine hohe Interferon-Antwort beobachtet, was darauf hindeutet, dass virale RNA-Komponenten erkannt werden. Um die speziellen angeborenen Signalwege zu identifizieren, die durch Ebola-RNA ausgelöst werden, wurden THP-1 Knock-out-Zelllinien, denen Schlüsselmoleküle der RNA- und DNA-Erkennungs-Wege fehlen, Ebolavirus-RNA ausgesetzt. Wie erwartet verlieren THP-1-Zellen, denen das Schlüsselmolekül des RNAErkennungsweges fehlt, die Fähigkeit, bei Stimulation mit Ebolavirus-RNA eine Immun- Reaktion auszulösen, was auf Mitglieder der RIG-I-ähnlichen Rezeptorfamilie als erste Sensoren hindeutet. In Protein Knockdown-Experimenten führte Ebolavirus-RNA Stimulierung nach Knockdown von RIG-I tatsächlich nicht mehr zu einer Immunantwort. Weiterhin wurden ADAR1 Knock-out-Zellen sowie Knock-out-Zellen erzeugt, die ADAR1p150, katalytisch inaktives ADAR1p150in und die ADAR1p110-Isoform stabil exprimieren. Ebolavirus-Partikel wurden in den entsprechenden Zellen oder Wildtyp- Zellen produziert, gefolgt von einer Ebolavirus-RNA-Extraktion. Die Zielzellen wurden mit der entsprechenden Ebolavirus-RNA transfiziert, und die angeborene Immun- Erkennung wurde gemessen, indem die Expression des IRF-3-Zielgens ISG54 überwacht wurde, sowie durch einen Western Blot für die IRF-3 Aktivierung. Es konnte gezeigt werden, dass Ebolavirus RNA, die aus Partikeln extrahiert wurde, die in Wildtyp-Zellen produziert wurden, nach Transfektion in primären myeloiden Zellen eine IRF-3- abhängige Reaktion auslöst. Interessanterweise induziert Ebolavirus-RNA, die in ADAR1 Knock-out-Zellen produziert wurde, nach der Transfektion in A549-Zellen eine stärkere Immun-Reaktion als RNA, die in Wildtyp-Zellen produziert wurde. Dies deutet darauf hin, dass ADAR1 ein negativer Regulator für die Immun-Erkennung von viraler RNA ist. Darüber hinaus ist die angeborene Reaktion auf Partikel-assoziierte RNA, die von Zellen stammt, die ADAR1p150 überexprimieren, im Vergleich zu RNA, die von ADAR1 Knockout- Zellen oder Zellen stammt, die die katalytisch inaktive Form von p150 oder die nukleäre Isoform p110 überexprimieren, deutlich geringer. Dies deutet darauf hin, dass eine starke RNA-Editierungsaktivität durch das aktive, durch Interferon stimulierte p150, aber nicht durch p110, die Fähigkeit zur Erkennung von Ebolavirus-RNA beeinflusst. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit zu einem besseren Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Ebolavirus und Wirt führt und ADAR1 als proviraler Faktor während der Ebolavirusinfektion und als negativer Regulator der angeborenen Erkennung von Ebolavirus-RNA etabliert. Ein besseres Verständnis der ersten Interaktionen zwischen Ebolavirus und angeborenen Regulatoren kann dazu beitragen, bessere therapeutische Strategien zu entwickeln.