Characterization of clinical S. aureus isolates from implant-associated infections with regard to adhesion to and invasion into osteoblasts

Implantatassoziierte Infektionen sind schwerwiegende Komplikationen in der orthopädischen Chirurgie. Neben S. epidermidis ist S. aureus der am weitesten verbreitete Erreger, der für orthopädische Infektionen verantwortlich ist. Behandlungen mit Antibiotika sind aufgrund der Biofilmbildung oder der intrazellulären Persistenz von S. aureus oft erfolglos. In der Literatur haben wenige Berichte S. aureus als fakultatives intrazelluläres Pathogen genommen. Diese Studie konzentriert sich auf Adhäsion, Invasion und intrazelluläres Überleben klinischer Isolate von S. aureus auf/in Osteoblasten. Von Implantat-assoziierten Infektionen erhaltene Isolate wurden mit API® Staph Test und 16S-rRNA-Sequenzierung bestimmt. Die weitere Charakterisierung erfolgte mittels clear-zone-formation, Collagenase- und Oxidasetest, Wachstumsanalyse, Antibiotikaresistenz- und Biofilmbildungsanalyse. Für Bakterien-Osteoblasten-Interaktionsstudien wurden S. aureus ATCC 29213 und acht S. aureus-Isolate (Pat 2, 4, 6, 9, 28, 36, 42, 45) sowie konfluente Schichten von Osteoblasten wie die Zelllinien SaOS2 und MG63 verwendet. Es wurde ein Standardinfektionsmodell mit S. aureus ATCC 29213 erstellt, um SaOS2 und MG63 zu infizieren. Auf der Grundlage dieses Modells wurden Adhäsions- und Invasionstests mit S. aureus-Isolaten durchgeführt. MTT- und Respirationstests wurden durchgeführt, um die Ergebnisse der metabolischen Aktivität der infizierten Osteoblasten zu erhalten. PCR und qPCR wurden eingesetzt, um Gene zu identifizieren, die an der Adhäsion beteiligt sind, und um das entsprechende Expressionsniveau zu bestimmen. Massenspektrometrie wurde für die quantitative Proteinanalyse eingesetzt. Induzierte und gehemmte Autophagie wurden mit Western Blot-Analysen durchgeführt, um die Rolle der Autophagie bei der Interaktion zwischen Bakterien und Osteoblasten zu analysieren. Basierend auf der Charakterisierung und Sequenzanalyse aus Sicht der Homologie wurden die Isolate Pat 2, 4, 6, 9, 28, 36, 42, 45 als S. aureus klassifiziert. Im Infektionsmodell wurde eine signifikant stärkere Adhärenz von S. aureus ATCC 29213 an SaOS2 statt an MG63 beobachtet. Bakterien, die in der stationären Wachstumsphase geerntet wurden, zeigten eine stärkere Adhärenz an Osteoblasten im Vergleich zu Bakterien, die in der logarithmischen Wachstumsphase geerntet wurden. Es wurde festgestellt, dass drei S. aureus-Isolate (Pat 36, 42, 45) stark an Osteoblasten anhaften und in diese eindringen. Die PCR zeigte, dass eno-, fnbA-, clfA-, clfB-, ebpS-, psmA-, psmB-, eap-, sdrD-, fmtB- und ebh-Gene in allen S. aureus-Isolaten exprimiert wurden. Darüber hinaus zeigte qPCR, dass clfA ein Kandidatengen im Zusammenhang mit der bakteriellen Adhärenz sein könnte, da es nur in adhäsiven S. aureus (Pat36, Pat42, Pat45) und S. aureus ATCC 29213 überexprimiert wurde. Der MTT-Assay zeigte, dass die metabolische Aktivität unabhängig von einer Infektion mit S. aureus war. Der Respirationsassay zeigte, dass die metabolische Aktivität sowohl der SaOS2- als auch der MG63-Zelllinien stimuliert wurde, nachdem sie mit ausgewählten S. aureus-Isolaten (Pat 9, 36 und S. aureus ATCC 29213) infiziert worden waren. Das Verhältnis von Zelladhäsion und Genexpression unter Biofilmbedingungen war nicht eng korreliert. Proteomanalysen zweier verschiedener Osteoblastenzelllinien mit oder ohne Infektion mit S. aureus zeigten, dass an der Adhäsion beteiligte Gene in Osteoblasten meist nicht exprimiert wurden. Mittels Massenspektrometrie waren nur Fibronektin und Kollagen nachweisbar. Zusammengenommen ist ersichtlich, dass weder das Vorhandensein der jeweiligen Gene noch der Genprodukte als ausreichender prädiktiver Marker für die Adhäsion angesehen werden kann. Genexpressionsanalysen deuten darauf hin, dass möglicherweise kein einheitlicher Mechanismus hinter der Adhäsion der untersuchten S. aureus-Isolate steht, sondern dass unterschiedliche Adhäsionsproteine beteiligt sind. Die erhöhte Adhäsion korreliert nicht mit einer erhöhten Invasion, was die Adhäsion als mögliches therapeutisches Ziel uninteressant macht. In Bezug auf das intrazelluläre Überleben wurde die Autophagie in den Wirtszellen nach der Infektion mit den hier getesteten S. aureus-Isolaten eingeschaltet, was auf einen Beginn der Autophagie hinweist, der unabhängig vom Ausgang war. Diese Studie zeigt eine ambivalente Rolle der Autophagiewege in Bezug auf die Clearance von S. aureus, was darauf hindeutet, dass Autophagie für eine Infektion notwendig, aber nicht ausreichend ist. Darüber hinaus unterscheidet sich die bakterieninduzierte Autophagie von einer hungerinduzierten Autophagie, was die Autophagie zu einer interessanten Behandlungsoption für die Implantat-assoziierte Infektion macht.