Engineering the Synthetic Capabilities of a Modular Type I Polyketide Synthase

Polyketide sind eine große Klasse von Naturstoffen, die biologische Aktivitäten wie antibakterielle, antivirale oder antitumorale Wirkung haben. Die Aufklärung der ihnen zugrundeliegenden Biosynthesemaschinerie, der Polyketidsynthasen (PKS), hat gezeigt, dass Polyketide aus einfachen Acyl- und Malony-Coenzym A-Thioester-Bausteinen bestehen. Zudem kann deren Substratspezifität und Stereokonfiguration in äußerst vorhersehbarer Weise anhand der DNS-Sequenz abgeleitet werden. Die Aussicht, diese Enzyme zu nutzen und zu modifizieren um Designer-Polyketide herzustellen, hat daher seit mehreren Jahrzehnten die Aufmerksamkeit der Forschung auf sich gezogen. Die Verfügbarkeit eines breiten Spektrums von Substraten ist eine grundlegende Voraussetzung für die Untersuchung und Entwicklung der Substratspezifität von PKS. Um diese Anforderungen zu erfüllen, wurden mehrere chemo-enzymatische Strategien für deren in vitro-Synthese entwickelt. Jeder dieser Wege hat jedoch inhärente Nachteile und liefert entweder das falsche Stereoisomer oder erfordert eine chemische Vorläufersynthese. Diese Arbeit beschreibt einen von der Natur inspirierten, vollständig enzymatischen Syntheseweg zur Erzeugung von Polyketid-Extender-Einheiten aus Carbonsäuren durch Ligation, Oxidation und Carboxylierung in einem Ansatz. Unter Umgehung der chemischen Vorläufersynthese erwies sich diese Methode als hocheffizient für aliphatische Substrate und ermöglichte eine ertragreiche Synthese der entsprechenden Extender-Einheiten im präparativen Maßstab. Erfolgreiche technische Bemühungen zur Erleichterung des Einbaus von nicht nativen Extender-Einheiten in PKS haben sich weitgehend auf die spezifitätsverleihende Acyltransferase (AT)-Domäne konzentriert und wurden meist in terminalen oder eigenständigen Modulen durchgeführt. Durch die Ausweitung des Untersuchungsraums für die ortsspezifische Mutagenese auf andere Domänen als die AT (z. B. Ketoreduktase und Ketosynthase) werden in dieser Arbeit deren Auswirkungen auf den Substrateinbau in einer vollständig rekonstituierten Polyketid Synthase in vitro beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutagenese dieser Domänen die Verarbeitung von nicht-nativen Zwischenprodukten durch erhöhte Promiskuität stark beeinflussen kann. Darüber hinaus reichte eine einzige Aminosäure-Substitution in der Ketosynthase-Domäne aus, um die Substratspezifität durch die Schaffung eines begleitenden Shunt-Mechanismus vollständig umzukehren. Diese Erkenntnisse führten zur Entwicklung eines alternativen Weges, um eine Spezifität für die Versorgung mit Extender-Einheiten durch orthogonal hinzugefügte, an ein Acyl-Carrier-Protein gebundene Thioester zu erreichen. Trotz der Vielzahl von PKS-Engineering-Ansätzen in verschiedenen Kontexten gibt es nur wenige Überschneidungen mit breiteren Forschungsfeldern der synthetischen Biologie, wie z. B. der Entwicklung künstlicher Stoffwechselwege. Um diese Lücke zu schließen, zeigt diese Arbeit die erfolgreiche Kombination einer Polyketidsynthase mit einem künstlichen CO2-Fixierungszyklus. Zwischenprodukte dieses Zyklus würden als Substrate für die Polyketidproduktion dienen und somit die kontinuierliche CO2-Fixierung stoppen. Dies wurde vermieden, indem anaplerotische Rückkopplungswege in das Stoffwechselnetz eingebaut wurden, die die Umwandlung des Ausgangsmoleküls des Zyklus (Glyoxylat) zurück in Zwischenprodukte katalysieren. Das so entstandene metabolische in vitro-Netzwerk, das aus mehr als 20 Enzymen besteht und bis zu 50 Reaktionen katalysiert, war in der Lage, aus dem Ausgangssubstrat und CO2 Polyketide mit vergleichbaren Ausbeuten zu produzieren wie die isolierte PKS, welche mit einem Überschuss an Substraten versorgt wurde.