Machine learning guided optimization of an artificial carbon dioxide fixation cycle and its extension towards value-added compounds

Der globale Kohlenstoffkreislauf ist ein hochgradig ausgewogenes System welches den Kohlenstoffaustausch zwischen Geo-, Hydro- und Atmosphäre umfasst. Seit der industriellen Revolution ist die Verbrennung fossiler Brennstoffe der Hauptgrund für den Anstieg des Kohlenstoffgehalts in der Atmosphäre, sowie im Wasser. Zwar ist die Konzentration an Kohlenstoffdioxid (CO2) in der Luft nach wie vor sehr gering, da es jedoch aufgrund seiner strukturellen Eigenschaften ein hochwirksames Treibhausgas ist, hätte eine Verdopplung der Menge katastrophale Auswirkungen auf das Klima. Seine Fähigkeit Infrarotlicht zu absorbieren, welches sonst ins Weltall entweichen würde, führt zu einem Anstieg der atmosphärischen Temperaturen. Da CO2-Moleküle sehr stabil sind, ist die Umwandlung in langkettige Kohlenstoff-Moleküle sehr energieaufwändig und erfolgt hauptsächlich durch Organismen die Licht als Energiequelle nutzen. Die Hauptakteure bei der Aufnahme von CO2 aus der Atmosphäre sind daher Pflanzen und Algen, die den Kohlenstoff zur Erzeugung von Biomasse aufnehmen. In diesen komplexen Organismen ist die Ribulose-1,5-Bisphosphat Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO) für die Carboxylierung verantwortlich. RuBisCO gilt als langsamer Katalysator mit einer hohen Fehlerquote bei der Aufnahme von Sauerstoff (O2) anstelle von CO2. 2016 wurde eine Studie von Schwander et al. veröffentlicht, in welcher ein neuartiger Stoffwechselweg zur Fixierung von CO2 vorgestellt wurde. Der sogenannte Crotonyl-Coenzym A (CoA)/Ethylmalonyl-CoA/Hydroxybutyryl-CoA (CETCH)-Zyklus wurde entwickelt, um RubisCO zu umgehen. Im Gegensatz zum Calvin-Zyklus basiert der CETCH-Zyklus auf einer hocheffizienten Crotonyl-CoA Carboxylase/Reduktase (Ccr), bei der keine Nebenreaktionen mit Sauerstoff auftreten. Aufgrund der Nutzung von Ccr und dem restlichen Aufbau des Stoffwechselweges hat der CETCH-Zyklus eine höhere Nettowirksamkeit als natürliche aerobe CO2-Fixierungswege und hat somit das Potential, eine wichtige Rolle bei der Reduzierung des atmosphärischen CO2-Gehalts zu spielen. Um Einblicke in dieses komplexe in vitro Reaktionsnetzwerk aus mehr als 25 Komponenten zu gewinnen, haben wir eine Hochdurchsatzverfahren etabliert um Hunderte von Reaktionsbedingungen gleichzeitig zu testen. Voraussetzung war die Implementierung eines akustischen Pipettier-Roboters mit einem minimalen Pipettiervolumen von 25 nl. Dies ermöglichte einen schnelleren Durchsatz und eine drastische Verringerung des Reaktionsvolumens ohne Verluste bei der Pipettiergenauigkeit. Die gewonnenen Daten wurden verwendet um einen XGBoost-basierten Machine Learning Algorithmus zu trainieren, um die Reaktionsparameter des CETCH-Zyklus zu optimieren. Durch fünf Runden Optimierung konnten die Reaktionsparameter so verändert werden, dass der CETCH-Zyklus im Vergleich zur publizierten Version von 2016 um den Faktor zehn verbessert werden konnte. Darüber hinaus konnten durch den Algorithmus die wichtigsten Komponenten des Stoffwechselwegs identifiziert werden und ein Enzym als potentieller Engpass ausgemacht werden. Des weiteren konnte durch anschließende Experimente gezeigt werden, dass der Verlust von Metaboliten durch Nebenreaktionen oder Hydrolyse der begrenzende Faktor ist. Neben der Optimierung des CETCH-Zyklus erweiterten wir dessen Produktportfolio um CO2 direkt in höherwertige Chemikalien umzuwandeln. Zu diesem Zweck koppelten wir zunächst den CETCH-Zyklus mit dem β-Hydroxyaspartat-Zyklus. Dies ermöglichte die Herstellung von Oxaloacetat aus zwei Molekülen Glyoxylat. Durch drei weitere Enzyme aus dem Serin-Zyklus konnten wir Acetyl-CoA synthetisieren, welches wir zur Herstellung verschiedener Terpene verwendeten. Zwar konnten wir die Produktion von verschiedenen Stoffen demonstrieren, die Synthese beschränkte sich jedoch auf Produkte welche aus dem Primärprodukt Glyoxylat gewonnen werden. Die Nutzung von CETCH Metaboliten war nicht möglich, da dies zu einem vorzeitigen Stillstand der CO2-Fixierung führen würde. Um die Konzentrationen von CETCH-Metaboliten zu erhöhen, implementierten wir von der Natur inspirierte, anaplerotische Sequenzen, welche das fixierte CO2 in den Zyklus zurückführen. Dazu rekonstituierten wir erfolgreich vier anaplerotische Routen, von welcher drei die Produktion des Polyketids 6-Desoxyerythronolid B (6-dEB) ermöglichten. Die Biosynthese von 6-dEB (C21) erfordert ein Molekül Propionyl-CoA und sechs Moleküle Methylmalonyl-CoA, beides Zwischenprodukte des CETCH-Zyklus. Durch die Biosynthese komplexer Moleküle aus CO2 in hochgradig komplexen Stoffwechselwegen mit über 50 Reaktionen konnten wir die Robustheit und Vielseitigkeit des CETCH-Zyklus demonstrieren.