Molecular biological analysis of the role of placenta-specific 8 in the context of tumour progression in pancreatic ductal adenocarcinoma

Trotz intensiver Forschung ist die Prognose für Patienten, die an einem Pankreaskarzinom erkranken, mit einer 5‑Jahres Uf berlebensrate von nur 9‑10 % weiterhin sehr schlecht. Gründe dafür sind unter anderem das Fehlen von spezifischen Symptomen und geeigneten Biomarkern zur Früherkennung, die hohe Aggressivität dieser Krebserkrankung, die hohe Therapieresistenz gegenüber den zur Zeit verfügbaren Therapieformen sowie die hohe Heterogenität zwischen den einzelnen Tumorerkrankungen. Aus den genannten Gründen ist es zwingend erforderlich, Biomarker zu finden, die eine frühere Diagnosestellung ermöglichen, sowie effektivere, auf den jeweiligen Tumor abgestimmte Therapieformen zu entwickeln. Da unsere Arbeitsgruppe PLAC8 als ein stark überexprimiertes Gen in einer Subgruppe von pankreatisch duktalen Adenokarzinomtumoren identifizieren konnte, könnte für Patienten mit Tumoren dieser Subgruppe eine Targeted Therapy, die gegen PLAC8 oder ein downstream von PLAC8 reguliertes Gen gerichtet ist, eine neue Therapieform darstellen. Da diese Therapie spezifischer als die herkömmlichen Krebstherapien auf den Tumor wirken würde, könnte mit einer solchen Therapie die Prognose für diese Patienten verbessert werden. Analysen bezüglich der Wirkungsweise von PLAC8 zeigten, dass PLAC8 über den Eingriff in den Zellzyklus die Proliferation von pankreatisch duktalen Adenokarzinomzellen fördert. Weitere Analysen von CRISPR/Cas9 Klonen ließen außerdem die Schlussfolgerung zu, dass dieses nicht über das PLAC8 Protein, sondern über die PLAC8 RNA vermittelt wird. Basierend darauf wurde vermutet, dass die PLAC8 RNA ähnlich wie eine long non‑coding RNA auf die Proliferation dieser Zellen wirken könnte. Würde diese These tatsächlich zutreffen, würde sich dieses unter anderem darin zeigen, dass es nicht möglich sein sollte, eine PLAC8 RNAde fiziente pankreatisch duktale Adenokarzinomzelllinie zu generieren, da eine solche Zelllinie nicht mehr proliferations‑ und somit lebensfähig wäre. Ein Ziel dieser Arbeit war, diese These zu prüfen. Ein weiteres Ziel war außerdem, den genauen Wirkmechanismus von PLAC8 auf molekularer Ebene zu entschlüsseln. Um sich diesen Zielen zu nähern, sollte zunächst untersucht werden, ob sich bei der Analyse von weiteren CRISPR/Cas9 Klonen, die von der pankreatisch duktalen Adenokarzinomzelllinie S2‑007 abstammten, die Gegenselektion gegen eine PLAC8 RNA‑defiziente Zelllinie weiter bestätigen würde. Würde sich dieses zeigen, sollte in weiteren CRISPR/Cas9 Ansätzen untersucht werden, ob es möglich wäre, den endogenen PLAC8 Lokus mittels CRISPR/Cas9 auszuschalten, vorausgesetzt, dass gleichzeitig ein rekombinantes, nicht‑kodierendes PLAC8 Konstrukt in die Zelle eingebracht wird. Die Idee dabei war, dass das PLAC8 Konstrukt ‑ nach genomischer Integration ‑ die Funktion des endogenen PLAC8 Lokus übernehmen könnte und somit das Ausschalten dieses Lokus ermöglichen würde. Wäre dies möglich, wäre dies ein starkes Indiz dafür, dass die Ausgangsthese richtig ist und würde zudem zeigen, welche der in S2‑007 Zellen exprimierten PLAC8 Transkriptvarianten die für die Proliferationsfähigkeit dieser Zellen essentielle/n ist/sind. Um ein genaueres Bild von der Wirkungsweise von PLAC8 auf molekularer Ebene zu erlangen, sollten RNA Sequenzierungen mit cDNA Proben von S2‑007 Zellen mit und ohne PLAC8 Knockdown durchgeführt werden. Würden sich hier nach PLAC8 Knockdown veränderte Expressionsmuster in Genen zeigen, würden daran anschließend weitere Analysen durchgeführt werden, um einen funktionellen Zusammenhang zwischen diesen Genen und PLAC8 zu prüfen. Die bereits zuvor beobachtete Gegenselektion gegen eine PLAC8 RNA‑defiziente S2‑007 Zelllinie konnte im Rahmen der in dieser Arbeit vorgestellten Analysen weiter gestärkt werden. So hatte sich zunächst gezeigt, dass es trotz der Analyse von 38 CRISPR/Cas9 Klonen, die von dem PLAC8 Protein‑defizienten S2‑007 Klon G2#1 abstammten, nicht möglich gewesen war, den endogenen PLAC8 Lokus und somit die PLAC8 RNA Expression auszuschalten. Da dieser Klon auf Grund eines vorausgegangenen CRISPR/Cas9‑vermittelten Genome Editing (unter Verwendung einer Donorkassette mit Transkriptiosstopp‑Signal) nur noch über ein verbliebenes „wildtyp“‑Allel am PLAC8 Lokus verfügt hatte und die CRISPR/Cas9 Technologie grundsätzlich sehr effektiv ist, deutet dies sehr stark darauf hin, dass die PLAC8 RNA für die Lebensfähigkeit der S2‑007 Zelllinie essentiell zu sein scheint. Zusammen mit der Tatsache, dass für PLAC8 Protein‑defiziente S2‑007 Klone weiterhin ein Wachstums‑inhibierender Phänotyp nach der Behandlung mit PLAC8‑spezifschen siRNAs nachgewiesen werden konnte, kann dieses Ergebnis darauf zurückgeführt werden, dass die Expression der PLAC8 RNA für die Proliferationsfähigkeit der S2‑007 Zellen essentiell zu sein scheint, was das Entstehen einer PLAC8 RNA‑defizienten Zelllinie verhindert. Diese These wird weiterhin dadurch gestärkt, dass es auch in 248 weiteren CRISPR/Cas9 Klonen, die sowohl von dem Klon G2#1 als auch der Ausgangszelllinie S2‑007 abstammten, nicht möglich gewesen war, einen Knockout im endogenen PLAC8 Lokus zu erzeugen. Das bei der Herstellung dieser Klone eigentlich verfolgte Ziel, den endogenen PLAC8 Lokus auszuschalten und die essentielle Funktion dieses Lokus durch das Einbringen eines rekombinanten PLAC8 Konstrukts zu ersetzen, konnte bis jetzt noch nicht erfolgreich umgesetzt werden. Aus diesem Grund ist es weiterhin nicht möglich, eine Schlussfolgerung dahingehend zu treffen, ob eine oder mehrere der in S2‑007 Zellen exprimierten PLAC8 Transkriptvarianten für die Proliferationsfähigkeit dieser Zellen essentiell ist/sind. Da im Rahmen von Long‑Read Sequenzierungen 6 verschiedene PLAC8 Transkriptvarianten in cDNA Proben von S2‑007 Zellen identifiziert werden konnten, liegt es nahe anzunehmen, dass über eine oder mehrere dieser Transkriptvarianten die Proliferation der S2‑007 Zellen reguliert wird. Im Rahmen dieser Arbeit war es bis jetzt noch nicht möglich, einen genauen Wirkmechanismus von PLAC8 auf molekularer Ebene nachzuweisen. Die Ergebnisse der RNA Sequenzierungen hatten zwar für die Gene E2F1, E2F2 und E2F5 sowie HYOU1, CHPT1, TGOLN2 und B3GALT5 eine Herunterregulation in der RNA Expression nach PLAC8 Knockdown gezeigt, doch konnte bis jetzt für keines dieser Gene in weiteren Analysen ein funktioneller Zusammenhang mit PLAC8 bestätigt werden. Damit ist weiterhin offen, ob PLAC8 in seiner Rolle als long non‑coding RNA über die Regulation eines oder mehrerer dieser oder anderer Gene seinen pro‑proliferativen Effekt in S2‑007 Zellen vermittelt.