Single-molecule Dynamics and Localization of mRNAs, ribosomal Protein L1 and the membrane remodeling protein DynA in Bacillus subtilis

In dieser Arbeit ist das Verfahren der Einzelmolekül-Verfolgung, in Kombination mit der SMTracker Software, die wichtigste Mikroskopiemethode, um Daten zu generieren und zu analysieren. Damit können verschiedenen Prozesse im Millisekundenbereich mit einer hohen optischen Auflösung in lebenden Zellen/Bakterien untersucht werden. Durch neue Erkenntnisse, u.a. durch verbesserte Methoden, müssen verschiedene, bis dahin als etabliert betrachtete Theorien, überdacht werden. So auch die Proteinbiosynthese in Bakterien. Eine zeitliche und räumliche Trennung von Transkription und Translation dieser beiden Prozesse in verschiedenen Bakterienspezies wird immer wahrscheinlicher. In welchem Ausmaß dies geschieht, ist jedoch noch unklar. Dafür existieren zwei generelle Modelle, die zu erklären versuchen, wo die mRNA-Translation stattfindet und ob dies ein von der Transkription getrennter oder damit gekoppelter Vorgang ist: 1.) Die mRNA verbleibt in der Nähe ihres Transkriptionsortes, wobei das bakterielle Chromosom als Vorlage fungiert – bei dem sowohl eine Kopplung von Transkription und Translation als auch eine Trennung möglich ist -, oder 2.) mRNAs lokalisieren sich dort, wo das zu kodierende Protein später benötigt wird. Transkription und Translation sind damit eher räumlich und zeitlich voneinander getrennt. Wichtig ist, diese Modelle können für verschiedene Bakterienspezies unterschiedlich zutreffend sein. Diese Arbeit beschäftigt sich im Wesentlichen mit der Frage, wo die Translation verschiedener mRNAs in dem Gram-positiven Bakterium Bacillus subtilis stattfindet und welche Dynamiken sie aufweisen. Für diese Arbeit wurde die bereits vielfacht genutzte RNA-Markierungsmethode, das MS2-System, verwendet, das vorab ein wenig abgeändert werden musste, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die Ergebnisse zeigen, dass bereits ein und zwei Wiederholungen der MS2-Bindesequenz ausreichend sind, um mRNAs mit dem MS2-System zu detektieren. In diesem Zusammenhang konnte aufgezeigt werden, dass eine unspezifische Bindung des MS2-Bindeproteins auftritt und das Wachstum von Zellen, die dies exprimieren, unabhängig von der Koexpression der dazugehörigen Bindestelle, beeinflusst. Trotzdem ist der Nachweis von mRNAs damit möglich. Um der Frage nachzugehen, wo die Translation in B. subtilis stattfindet, wurden mRNAs, die für lösliche, membranständige und extrazelluläre Proteine kodieren, verwendet. Die Lokalisierung dieser mRNAs gibt einen Einblick, wo die Translation stattfinden könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit passen dabei weder ausschließlich zu Modell 1) noch zu Modell 2), besitzen jedoch Merkmale beider Modelle. Sämtliche getesteten mRNAs weisen eine Lokalisation an den Polen und der Umgebung des Nukleoids auf, wobei mRNAs, die für Membranproteine kodieren, eine Tendenz zur Membran aufzeigen. Die Koexpression und Ko-lokalisation einer mRNA, ypbR-ypzF, und eines der daraus kodierten Proteine, DynA, unterstützt die Annahme, dass eine mRNA und ihr Proteinprodukt kolokalisieren könnten. Diese Untersuchung umfasst ferner die Dynamiken von mRNAs, die in bisherigen Studien hauptsächlich auf indirekte oder theoretische Weise ermittelt wurde. Die Erkenntnis, wie sich mRNAs in der Zelle bewegen, lässt sich am besten durch die Annahme von mindestens zwei, möglicherweise drei Populationen erklären, wobei eine statische Population wahrscheinlich die Translation der mRNA abbildet, ein möglicher Übergangskomplex mit den ribosomalen Untereinheiten vorhanden ist, sowie eine frei diffuse Population existiert, wenn von drei Populationen ausgegangen wird. Die quadratische Verschiebungsanalyse (square displacement analysis) zeigt zudem, dass die Diffusionskonstanten und damit die Geschwindigkeit der mRNAs größenunabhängig zu seinen scheint und sich mRNAs innerhalb weniger Sekunden überall in der Zelle hinbewegen können, wobei sie deutlich langsamer sind als zytosolische Proteine. Auch der Zusammenbau des Ribosoms spielt hierbei eine wichtige Rolle und wird wahrscheinlich bereits indirekt durch die mRNA Untersuchung wiedergegeben. Die generierten Daten des ribosomalen Proteins der 50S Untereinheit, L1, mittels Einzelmolekül-Verfolgung unterstützt dies zusätzlich. Neben dessen Lokalisation wurde erstmals in einem Gram positiven Bakterium, dessen Dynamik untersucht. Hier kann von mehr als drei Populationen ausgegangen werden, wobei die statische Population, die eine mögliche Translation darstellt, der statischen Population der untersuchten mRNAs entspricht. Daneben kann eine schnelle, frei diffuse Population beobachtet werden, sowie die Bildung eines Übergangskomplexes mit mehreren Zwischenprodukten, was für den dynamischen, komplexen Aufbau des Ribosoms spricht und mit den mRNA Daten übereinstimmt. Des Weiteren passen die Lokalisationsdaten zu den gewonnenen Ergebnissen der mRNAs und untermauert diese. Das bakterielle Dynamin-ähnliche Protein, DynA von B. subtilis, wurde nicht nur für Kolokalisationsanalysen mit seinem mRNA-Transkript verwendet, sondern auch weitergehend charakterisiert. Dieses Protein ist an der Zellteilung beteiligt und spielt dort eine wichtige Rolle bei der Membranfusion der sich frisch geteilten Zelle. Darüber hinaus sind Zellen, denen DynA fehlt, weniger resistent gegenüber Phagenbefall und Membranstress, der durch chemische Reagenzien induziert wird. Welche Art von Membranstress für die Rekrutierung von DynA verantwortlich ist, ist jedoch nicht vollständig geklärt. Mit Hilfe von Epifluoreszenzmikroskopie und Einzelmolekül-Verfolgung konnte ich zeigen, dass DynA nur auf spezielle Stressfaktoren reagiert, wahrscheinlich induzierte Poren in der Membran, die durch das Angreifen von Komponenten des Lipid II entstehen. Außerdem konnte bei der Untersuchung der Dynamik von DynA drei unterschiedliche Populationen der Mobilität gefunden werden. Eine statische Population, die an der Membranfusion beteiligt ist, u. a. während der Zellteilung und bei der Behebung von Membranschäden– ein Vorgang, der verhältnismäßig schnell vonstattengeht -, eine langsam mobile Population, die nach möglichen Membranschädigungen sucht, sowie eine Population für wahrscheinlich frei diffundierende DynA-Moleküle, die eine bisher nicht bekannte zytoplasmatische Lokalisation aufweist. Wichtig dabei ist, dass bereits eine geringfügige Änderung in der Anzahl der DynA-Moleküle ausreichend ist, um die durch die Antibiotika verursachten Schäden zu beheben.