Spatiotemporal analysis of cell wall synthesis related enzymes and the influence of cell wall stress factors

Bakterien haben ein vielseitiges Erscheinungsbild, welches größtenteils durch die Zellwand und andere formgebende Komponenten beeinflusst wird. Trotz jahrzehntelanger Forschung auf dem Gebiet der Zellwandsynthese gibt es immer noch viele offene und ungeklärte Fragen zur Organisation des bakteriellen Peptidoglykan Sacculus, aber auch zur räumlichen und zeitlichen Verteilung der an der Peptidoglykan Synthese beteiligten Proteinen, die sogenannten Penicillin Binde Proteine oder kurz PBPs, welche die letzten Reaktionen der Peptidoglykansynthese katalysieren. Das Bacillus subtilis Genom kodiert für eine große Anzahl von verschiedenen PBPs mit verschiedenen enzymatischen Eigenschaften bei denen jedoch nicht immer bekannt ist, wann oder unter welchen Bedingungen diese aktiviert werden. Einige PBPs sind dafür bekannt mit Proteinkomplexen, Elongasom and Divisom genannt, zu interagieren, welche für die Zellwandsynthese zuständig sind und meiste durch Zytoskelettelemente wie MreB und FtsZ organisiert werden. Um die Lokalisation und Funktion besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit verschiedene PBPs und MreB, als Indikatoren für den Ort der Zellwandsynthese, unter verschiedenen Bedingungen untersucht, wobei der Fokus auf der zeitlichen und räumlichen Verteilung dieser Proteine lag. Fünf PBPs wurden exemplarisch aus den verschiedenen Klassen ausgewählt und n-Terminal mit einem mVenus-Fluorophor fusioniert. Diese wurden mit Hilfe einer hochauflösende zeitliche und räumliche Mikroskopie Technik die Einzel-Molekül Verfolgung („Single-molecule-tracking“ genannt) untersucht und der Diffusionskoeffizient der Moleküle wurde bestimmt. Zwei verschiedene dynamische Populationen wurden entdeckt und nachgewiesen: eine langsam diffundierende, wahrscheinlich enzymatisch aktive, und eine schnelle, frei bewegliche inaktive Molekül-Population. Wobei die meisten PBPs 50% langsame Moleküle aufweisen und damit ungefähr die Hälfte der Moleküle an Substrat gebunden ist. Darüber hinaus sollte die Reaktion der PBPs auf verschiedene Umweltfaktoren getestet werden, dazu wurden die Zellen mit osmotischen Stressoren (NaCl und Sorbitol) sowie mit Antibiotika (Vancomycin, Penicillin G, Nisin, Fosfomycin und Bacitracin) behandelt. Hierbei konnten Veränderungen des Diffusionskoeffizienten der Proteine festgestellt werden. Vor allem wenn die Verfügbarkeit der Peptidoglykanbausteine durch die Anwesenheit der Antibiotika abweicht. Auch MreB reagiert auf die verfügbare Menge von Peptidoglykanbausteinen mit einer Veränderung der dynamischen Populationen, allerdings nicht so stark wie die meisten untersuchten PBPs. Des Weiteren wurde an die Ergebnisse einer vorherigen Doktorarbeit der Arbeitsgruppe angeknüpft (geschrieben von Dr. Simon Dersch). Die Reaktionen von am Elongasom beteiligten Proteinen (PbpH, Pbp2a und MreB) und jeweiligen Deletionen (∆pbpA und ∆pbpH) bzw. Depletion (MreB wurde durch ein Cas9 System in der Zelle auf ein niedriges Niveau gebracht) wurden im genetischen Hintergrund mit denselben Antibiotika untersucht. Die Dynamiken der beiden redundanten Transpeptidasen PbpH und Pbp2a veränderten sich merkbar im korrespondierenden Deletionsstamm unter dem Einfluss der Antibiotika. Während das niedrige Niveau von MreB in der Zelle nur einen geringen Einfluss auf die Diffusionskonstanten von PbpH oder Pbp2a hat, verändert sich das Verhalten von PbpH doch stark unter dem Einfluss von Antibiotika.