Design and Synthesis of Allosteric Inhibitors against Dengue Virus Protease

Obwohl Denguefieber mit etwa 390 Millionen Infektionen pro Jahr die weltweit häufigste durch Arthropoden übertragene Krankheit ist, gibt es bisher keine zugelassene spezifische therapeutische Behandlung. Daher befasste sich diese Arbeit mit dem Design und der Synthese neuartiger allosterischer DENV-Proteaseinhibitoren als potenzielle Wirkstoffe gegen das Denguefieber. Als Ausgangspunkt wurde ein in silico High Throughput Screening (HTS) durchgeführt, das die allosterische Tasche der geschlossenen Konformation der DENV3-Protease als Rezeptor und die ZINC15 Lead-Like Bibliothek als Input für das Docking verwendete. Dies führte zu einer Auswahl von 15 Verbindungen, die gekauft und in einem fluoreszenzbasierten Enzym-Assay in vitro getestet wurden. Die wirksamste Verbindung aus diesem Set zeigte einen vielversprechenden IC50-Wert von 136 +/- 16 mikromolar gegen die DENV3-Protease sowie einen nicht-kompetitiven Bindungsmodus und wurde erfolgreich auf ein Leitfragment reduziert, das ebenfalls eine signifikante Hemmung der DENV-Protease zeigte. Dieses Leitfragment diente als Ausgangspunkt für einen in silico Fragment growing-Ansatz, der nach Docking und Bewertung zu einer Auswahl von 17 Verbindungen führte, die synthetisiert und ebenfalls in vitro getestet wurden. Vier dieser Verbindungen zeigten eine signifikant erhöhte Aktivität gegenüber der DENV3-Protease im fluoreszenzbasierten Assay im Vergleich zum initialen Screening-Hit, wobei die effektivste Verbindung einen IC50-Wert von 28 +/- 7.9 mikromolar gegenüber der DENV3 Protease zeigte. Ein allgemeines strukturelles Motiv, das den wirksamsten Inhibitoren gemeinsam ist, wurde identifiziert und als Vorlage für eine umfassende Structure-Activity Relationship (SAR) Studie verwendet, die wichtige Merkmale der Protein-Ligand-Interaktionen aufdeckte. Die wirksamste Verbindung in der SAR-Studie (IC50(DENV3)=12.3 +/- 3.5 mikromolar) zeigte auch eine hohe Wirksamkeit gegenüber einem binären DENV4-Proteasekonstrukt und gegen die ZIKV-Protease, mit einem IC50-Wert gegen letztere im niedrigen mikromolaren Bereich. Der nicht-kompetitive Bindungsmodus wurde auch für die optimierten Ligandenstrukturen bestätigt, und es wurden erste Mutationsexperimente durchgeführt, um die tatsächliche Bindungsstelle in der Protease zu klären. Zellbasierte Experimente zeigten eine geringe Zytotoxizität der etablierten Ligandenserie bei Konzentrationen von bis zu 25 mikromolar und eine relative Hemmung der ZIKV-Replikation von mehr als 50% bei Konzentrationen von 5-10 mikromolar. Insgesamt bilden die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse eine gute Grundlage für die weitere Entwicklung potenter flaviviraler Proteaseinhibitoren.