Mapping interactions between metabolites and transcriptional regulators at a genome-scale

Die Kontrolle und Regulation des mikrobiellen Metabolismus wird benötigt für die Aufrechterhaltung der Biosynthese von Grundbausteinen und Energie, aber auch um den Verlust von Energie zu verhindern und um eine schnelle Anpassung im Falle von sich ändernden Bedingungen zu ermöglichen. Deshalb werden das metabolische Netzwerk und der Fluss genetischer Information durch mehrere Regulationsebenen reguliert und Informationen zwischen Genexpression und Metabolismus übermittelt. Zu diesem Zweck dienen Metabolite als Schlüsselsignale des regulatorischen Netzwerks, welche den Metabolismus balancieren indem sie zum einen Proteinlevel anpassen und zum anderen die Aktivität von Enzymen regulieren. Diese Regulationen und Wechselspiele zu verstehen, ermöglicht es, metabolische Modelle und Netzwerke zu verbessen und gezielt zu verändern. Außerdem bietet es die Chance zur Entwicklung neuer Antibiotika und verbesserter Produktionsstämme. Daher ist es Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, welche regulatorischen Mechanismen der Zelle dazu dienen, genetischen Perturbationen entgegen zu wirken. Des Weiteren wird die Entwicklung neuer Methoden zur systematischen Kartierung von Protein-Metabolit Interaktionen und die Aufklärung deren Funktion innerhalb der Zelle dargelegt. Nachdem die Regulation von metabolischen Netzwerken in der Einleitung besprochen wird, beschreiben wir in Kapitel 1, wie Escherichia Coli (E. coli) auf genetische Perturbationen reagiert. Wir nutzen eine CRISPRi Stamm-Bibliothek mit 7177 Stämmen, um einen gepoolten Fitness-/Wachstumsversuch durchzuführen, welcher die puffernden Effekte des Metabolismus aufzeigt. Des Weiteren messen wir das Metabolom und Proteom von 30 einzelnen CRISPRi Stämmen, was es uns ermöglicht drei genspezifische Mechanismen zur Kompensation von genetischen Perturbationen aufzuklären. In Kapitel 2 nutzen wir die gewonnen Erkenntnisse aus Kapitel 1 und entwickeln eine Methode um systematisch Interaktionen zwischen Metaboliten und transkriptionellen Regulatoren in E. coli zu finden. Da CRISPRi zu einer Inhibition der Transkription des Zielgens führt, induziert dies spezifische Änderungen im Metabolom als auch Proteom. Deshalb kombinieren wir die gepoolte CRISPRi Stamm-Bibliothek mit einem fluoreszenten Reporter für Transkriptionsfaktor-Aktivität und extrahieren Zellen mittels Durchflusszytometrie, welche eine Reaktion des Reporters auf die sich ändernden Bedingungen zeigen. Durch die Messung des Proteoms und Metaboloms einiger dieser Stämme validieren wir bereits bekannte als auch neu gefundene Interaktionen. In Kapitel 3 stellen wir ein detailliertes Protokoll zum Arbeiten mit CRISPRi Stamm-Bibliotheken zur Verfügung. Wir erklären das Design und die Konstruktion von Plasmiden für kleine Guide-RNAs, sowohl für einzelne als auch gepoolte CRISPRi Stämme und erklären die Durchführung von Wachstumsexperimenten. Außerdem beschreiben wir die Durchführung und Analyse von Illumina Next-generation sequencing von gepoolten Stamm-Bibliotheken. Darüber hinaus erklären wir detailliert, wie einzelne Zellen aus der gepoolten Zell-Bibliothek mittels Durchflusszytometrie isoliert werden können. In Kapitel 4 zeigen wir eine Methode zur systematischen Kartierung von Interaktionen zwischen Metaboliten und Transkriptionsfaktoren mittels externer Perturbationen. Durch den Wechsel von einer E. coli Kultur zwischen optimalen Wachstumsbedingungen und der Limitation von Glucose, erzeugen wir starke Änderungen von Metabolit-Leveln und Transkriptions-Leveln. Die Berechnung von Transkriptionsfaktor-Aktivitäten mittels Transkriptions-Leveln und die Korrelation dieser mit Metabolit-Leveln, ermöglicht die Validierung von bereits bekannten Interaktionen, als auch das Finden von neuen Interaktionen, von welchen fünf mittels in vitro Bindeassays bestätigt werden. In Kapitel 5 untersuchen wir die Funktion von allosterischen Regulationen metabolischer Enzyme im Aminosäure Stoffwechsel von E. coli. Wir konstruieren 7 Mutanten von allosterisch-regulierten Enzymen und entfernen dadurch den Regulationsmechanismus. Durch Metabolom-Analysen, Proteomstudien und der Messung des biosynthetischen Flusses in diesen Mutanten zeigen wir, wie Allosterie die Einstellung von Enzym-Leveln in der Zelle ermöglicht. Des Weiteren wenden wir ein metabolisches Modell an und stören den Stoffwechsel der Zellen mittels CRISPRi und zeigen damit, wie gut angepasste Enzym-Level Zellen robuster gegen genetische Perturbationen machen.