Evaluation of Novel Particle Detection Methods and their Application to Characterize the Process of Protein Aggregation

Der Einsatz von Biopharmazeutika ist ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten. Diese biologischen Moleküle, bspw. therapeutische Antikörper, führen allerdings zu neuen Herausforderungen, denen sich die Pharmaindustrie stellen muss. Eine Herausforderung von therapeutischen Proteinen sind bspw. Aggregationsprozesse und folglich die Detektion der resultierenden Proteinpartikel mit geeigneten Methoden. Die Ziele dieser Arbeit waren daher die Evaluierung neuaufkommender Techniken für die Partikeldetektion und - charakterisierung, die Evaluierung neuer Technologien zur Untersuchung von Proteinentfaltungs- und Aggregationsprozessen und die Untersuchung des Aggregationsverhalten von drei therapeutischen Modellproteinen (monoklonale Antikörper). Für die Evaluierung neuaufkommender Techniken für die Partikeldetektion wurden drei Technologien untersucht: Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), Tunable Resistive Pulse Sensing angewendet in dem Gerät qNano (TRPS) und die STEP-technology® angewendet in dem Gerät LUMiSizer®. Die initiale Vergleichbarkeit der Technologien und der Analyseergebnisse wurde zunächst gezeigt mit Hilfe von Latexpartikel Standard Suspensionen. Die anschließende Analyse von drei BSA (bovine serum albumin) Proteinpartikel Standard Suspensionen (mit nominalen Partikelgröße BSA1~150 nm; BSA2~500 nm und BSA3~750 nm) zeigte, vor allem für die heterogeneren Suspensionen BSA2 und BSA3 mit höherer Polydispersität, schon erste Herausforderungen für die Techniken. Während der TRPS-Analyse (Coulter Counter Prinzip) traten die Blockade der Pore sowie eine Proteinschicht auf der Membran auf. Diese Probleme wurden während der Analyse von gestressten therapeutischen Antikörperproben bestätigt und das TRPS-Gerät wurde für die Anwendung für Proteinproben als ungeeignet bewertet. Für NTA und den LUMiSizer® konnte in einer detaillierten Evaluierung hingegen die Anwendbarkeit demonstriert werden. Das NTA, eine Lichtstreu-basierte Methode, bietet dabei eine quantitative Methode zur Bestimmung der Partikelgrößenverteilung im nanometer-Größenbereich (150 nm bis ca. 1000 nm). Die Herausforderung bildet dabei die Einstellung geeigneter Messparameter (z.B. Detection Threshold). Der LUMiSizer®, eine Photozentrifuge, ist hingegen nicht für Konzentrationsbestimmungen geeignet, ermöglicht allerdings eine non-destruktive Analyse der Partikelgrößenverteilung über den nanometer und mikrometer Größenbereich. Die Herausforderung der Methode ist eine ausreichende Trübung der Probe, um die Partikelbewegung detektieren zu können. Zur Untersuchung von Proteinentfaltungs- und Aggregationsprozessen wurden zwei Technologien evaluiert: der Zetasizer Helix, eine Kombination aus Dynamischer Lichtstreuung und Raman Spektroskopie und die SwitchSENSE Technologie, eine chip-basierter Biosensorplattform. Der Zetasizer Helix ermöglicht die simultane Untersuchung von Partikelbildung (kolloidaler Stabilität) und Proteinstrukturänderungen (konformative Stabilität). Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass dieser Ansatz für Proteinaggregationsstudien gut geeignet ist. Die SwitchSENSE Technologie bietet ein breites Einsatzgebiet. In dieser Arbeit konnte eine orthogonale Methode für die Untersuchung des Entfaltungsprozesses von mABs evaluiert werden. Für weitere Anwendungen zur Untersuchung von Proteinaggregation konnten keine neuen Vorteile durch die Verwendung der SwitchSENSE Technologie aufgezeigt werden. Im dritten Abschnitt der Arbeit wurden Aggregationsprozesse der Modellantikörper mAB1, mAB2 und mAB3 untersucht. Die Proteinsuspensionen wurden zunächst biophysikalisch untersucht, um die kolliodale und konformative Stabilität zu beschreiben. Während mAB1 und mAB2 vergleichbar stabil waren, zeigte mAB3 eine signifikant geringere Stabilität. Anschließend wurden die Aggregationsprozesse unter verschiedenen Stresskonditionen (u.a. Temperaturrampen, isothermer Stress oder extrem saurer pH-Wert) untersucht. Der Aggregationsprozess von mAB1 ist gekennzeichnet durch einen langsamen Verlauf, als rate-limiting Schritt kann der Entfaltungsschritt angenommen werden und der gesamte Prozess scheint entfaltungsgetrieben. Der Aggregationsprozess von mAB2 ist gekennzeichnet durch einen schnellen Verlauf, als rate-limiting Schritt kann die Formation eines irreversiblen Nukleus (Nukleationskontrolliert) angenommen werden und der Einfluss der Entfaltung scheint nach dem Aggregationsstart reduziert. Der Aggregationsprozess von mAB3 scheint hingegen gekennzeichnet durch Selbstassoziation der Monomere, einen schnellen Verlauf und als rate-limiting Schritt kann die Monomeraddition angenommen werden. Zusammenfassend konnten fünf neue Technologien evaluiert und in Aggregationsstudien implementiert werden, um die Aggregationsprozesse/-charakteristika von drei Modellantikörpern zu beschreiben. Die Beschreibung und das Verständnis von Aggregationsprozessen unterstützen die Entwicklung einer stabilen Formulierung von therapeutischen Proteinen und bildet daher einen wertvollen Beitrag für die Entwicklung solcher Biopharmazeutika.