Functional characterization of the TP53 mutome using CRISPR/Cas9 saturating mutagenesis

TP53 ist ein essentieller Tumorsuppressor, der in jedem zweiten Tumor inaktiviert vorliegt. In den meisten Fällen ist die Ursache hierfür eine missense Mutation, welche zur Expression eines veränderten p53-Proteins führt. Das mutierte p53 Protein ist nicht in der Lage eine unkontrollierte Proliferation zu verhindern und kann das Tumorwachstum im Falle von dominant-negativen oder gain of function Mutationen sogar aktiv unterstützen. Mutationen im TP53 Gen sind häufig assoziiert mit einem aggressiven Tumorwachstum, Chemoresistenz und einer kürzeren Überlebensspanne der Patienten. Aus diesem Grund ist der p53 Genstatus von hoher klinischer Relevanz. Darüber hinaus sind Informationen zu verschiedenen TP53 Mutationen essentiell für die Applikation vergleichsweise neuer Therapiestrategien, welche gezielt an p53 ansetzen: Mdm2-Inhibitoren und p53-Reaktivatoren. Die acht häufigsten so genannten Hotspot Mutationen versachen nahezu 30% aller in Tumoren gefundenen p53 missense-Mutationen und werden daher umfassend untersucht. Diese Hotspot Mutationen führen zur Produktion von transkriptionell inaktiven loss-of-function Proteinen. Die restlichen 70% der TP53 Mutationen bestehen aus mehr als 2000 unterschiedlichen p53 Varianten, von denen die meisten bisher nicht charakterisiert sind. Neben Tumor-assoziierten non-Hotspot Mutationen macht diese Vielzahl an Mutanten eine Vorhersage über ihren Einfluss auf die Erkrankung zu einer großen Herausforderung. Aus diesem Grund wäre es für eine verbesserte personalisierte Krebstherapie von großer Wichtigkeit, heraus zu finden, wie hunderte verschiedener individueller p53 Mutationen die Therapieantwort beeinflussen. Die funktionelle Charakterisierung hunderter Mutationen eines Gens ist eine umfassende Aufgabe, die zeitaufwendige in vitro und in vivo Studien beinhaltet. Daher wäre ein experimenteller Ansatz von großem Vorteil, welcher es erlaubt, umfangreiche phänotypische Screenings von p53 Mutanten parallel durchzuführen. In der vorliegenden Arbeit wurde das CRISPR-Cas9 System genutzt um das CRISPR-basierte gesättigte Mutagenese Screening (CRISPR-based saturated mutagenesis screening – CSMS) des TP53 Gens zu entwickeln, ein verbessertes System zum parallelen umfangreichen phänotypischen Untersuchung von p53 Mutanten. Wir haben damit ein schnelles und flexibles Protokoll entwickelt, um unter Einsatz des CRISPR-Cas9-induzierten homology-directed repair (Homologie-gerichtete Reparatur) p53 Mutationen in den endogenen TP53 Genlocus einzubringen. Das CSMS wurde mittels getättigter Mutagenese des kurzen Protein Motivs validiert und erwies sich als überaus erfolgreiche Methode. Wir haben unser Protokoll soweit verbessert, um eine Hochdurchsatz-Methode zu entwickeln, welche eine exakte funktionelle Charakterisierung von tausenden p53 Varianten ermöglicht. Wir haben die Effekte von p53 Mutationen auf das Ansprechen auf Mdm2-Inhibitoren und Bestrahlung untersucht und dabei eine herausragenden Korrelation zwischen den Ergebnissen des Screenings und bekannten strukturellen, funktionalen und klinischen Daten feststellen können. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass CSMS in der Lage ist selbst kleinste funktionelle Unterschiede zwischen Mutationen aufzuzeigen und partielle loss-of-function Mutanten identifizieren kann. Die Manipulation des endogenen TP53 Genlocus erlaubt es uns, die Effekte von Mutationen in nicht-kodierenden Regionen zu untersuchen, was bisher unmöglich war. Ein genauer Vergleich unserer Daten mit bisher publizierten Studien bewies, dass die in unserer Studie etablierte Methode eine deutlich genauere Kategoriosierung pathogener p53 Mutationen ermöglicht. Zusammegefasst können wir bestätigen, dass CSMS ein leistungsfähiges Instrument zur Katalogisierung von TP53 Mutationen darstellt. Diese Methode kann zukünftig genutzt werden, um den Nutzen von Mutationen im TP53 Gen als klinischen Biomarker zu verbessern.