The coincidence biosensor tubbyCT reveals local phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate synthesis at endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions

Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI(4,5)P2) ist ein essentielles Signallipid der Plasmamembran (PM) und in viele biologische Prozesse involviert. So spielt es beispielsweise eine wichtige Rolle bei Endo- und Exozytose, bei der Verankerung des Zytoskeletts an der Membran, sowie bei der Regulierung von Ionenkanälen. Die Aktivierung von Gq-gekoppelten Rezeptoren führt zum schnellen Abbau von PI(4,5)P2 durch die Phospholipase C-β (PLCβ), jedoch bedingen die dabei anfallenden sekundären Botenstoffe I(1,4,5)P3 und Diacylglycerin (DAG) auch eine zeitnahe PI(4,5)P2 Resynthese. PI(4,5)P2 wird durch Phosphorylierung aus Phosphatidylinositol (PI) gebildet, welches aus dem ER stammt und die PM durch nicht-vesikulären Lipidtransport erreicht. Dieser PI Transfer stellt einen essentiellen Schritt der PI(4,5)P2 Resynthese dar. Er findet an sogenannten ER-PM Junctions statt, hochspezialisierten Domänen, an denen die ER Membran über Proteine wie beispielsweise die Extended Synaptotagmins (E-Syts) mit der PM verbunden ist. Ein Anstieg an intrazellulärem Ca2+, hervorgerufen zum Beispiel durch Aktivierung der PLCβ, führt zu einem verminderten Abstand der beiden Membranen, was letztendlich den PI Transfer ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit habe ich die bevorzugte Assoziation des bekannten PI(4,5)P2 Sensors TubbyCT mit E-Syt3-enthaltenden ER-PM Junctions herausgefunden. Die Rekrutierung von TubbyCT an die ER-PM Junctions erfolgt durch Koinzidenz-Bindung an E-Syt3 und PI(4,5)P2, was ich unter anderem durch Kolokalisationsexperimente, Ko-Immunpräzipitationen und Manipulationen des PI(4,5)P2 Gehalts der PM gezeigt habe. Aufgrund der Koinzidenz-Bindungseigenschaften von TubbyCT eignet sich der Sensor zur Messung lokaler PI(4,5)P2 Dynamiken an ER-PM Junctions. So konnte zum ersten Mal, mittels Interner Totalreflexionsfluoreszenz (TIRF) Mikroskopie des fluoreszenzmarkierten TubbyCT, eine lokale Produktion von PI(4,5)P2 an ER-PM Junctions, während gleichzeitig stattfindender globaler Hydrolyse des Lipids durch die PLCβ, gezeigt werden. Pharmakologische Inhibierung der PI(4,5)P2 Resynthese machte des Weiteren deutlich, dass diese lokale PI(4,5)P2 Population für den Erhalt der ER-PM Junctions, sowie für die Reduktion des Abstands der beiden Membranen während der Aktivierung der PLCβ nötig ist. Zusammenfassend deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass PI für die Produktion von PI(4,5)P2 durch einen, an ER-PM Junctions assoziierten, Multienzymkomplex geschleust wird, also eine Metabolit-Kanalisierung während der PI(4,5)P2 Synthese stattfindet. Neben TubbyCT reichert sich auch das Volllängenprotein Tubby, sowie sein naher Verwandter TULP3 an ER-PM Junctions an. Bisher beschränkte sich die Funktion der Tubby-ähnlichen Proteine (TULPs) auf die Rekrutierung G-Protein gekoppelter Rezeptoren in Primärzilien, meine Daten jedoch deuten auf eine weitere, konservierte Funktion der TULPs an ER-PM Junctions hin.