Analysis of the molecular mechanisms of prestin-mediated cochlear amplification via a cysteine accessibility study

Prestin ist als das Protein identifiziert worden, welches für die Elektromotilität in Säugetieren verantwortlich ist. Es ist ein Mitglied der SLC26 (Solute Carrier) Familie, dessen Mitglieder als Anionentransporter fungieren. Im Gegensatz zu den anderen Mitgliedern ist das Säugetier-Prestin kein Anionentransporter und generiert stattdessen Elektromotilität. Nichtsäugetier-Prestin Orthologe wie das Prestin des Zebrabärblings sind Anionenaustauscher mit einer Stöchiometrie von 1:1, wobei ein Chloridanion im Austausch gegen ein zweiwertiges Anion transportiert wird. Basierend auf dem bakteriellen Uracil Transporter UraA wurde ein strukturelles Homologiemodell von Prestin mit einer 7+7 „inverted repeat“ Architektur entworfen. Der Mechanismus des SLC26-vermittelten Transports ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Welche Rolle dieser Transportmechanismus für die elektromotilen Eigenschaften von Prestin spielt, ist unklar. Basierend auf der hohen Sequenzhomologie transportfähiger und elektromotiler Prestin Orthologe entstand die Idee, dass beide Mechanismen verwandt sind und Elektromotilität aus einem Transportmechanismus entstanden ist. Dies wird ebenfalls dadurch belegt, dass das Motorprotein Prestin mit intrazellulären monovalenten Anionen interagiert und Konformationsänderungen nur in Anwesenheit dieser Anionen durchführt. Dennoch ist es nicht komplett verstanden, ob elektromotiles Prestin strukturelle Dynamiken durchläuft, welche denen transportfähiger Mitglieder der SLC26 Familie ähneln. Das Ziel der vorgelegten Studie war es aufzuklären, ob die Funktion der SCL26 Transporter und spannungsgetriebener Motorproteine gemeinsamen strukturellen Prinzipien folgt. Um dies zu erreichen, wurden zwei Mitglieder der SLC26 Familie als Modellsysteme ausgewählt: das Nichtsäugetier-Prestin des Zebrabärblings und das Säugetier-Prestin der Ratte. Die hauptsächlich angewandte Methode in dieser Studie war eine Cystein Zugänglichkeitsstudie. Dadurch können Strukturen identifiziert werden, welche ihre Zugänglichkeit zum wässrigen Medium entsprechend ihrer Bewegung während eines Transportzyklus ändern. Die membranundurchlässigen MTS Reagenzien wurden entweder von der intrazellulären oder der extrazellulären Seite appliziert. Im Prestin der Ratte und des Zebrabärblings wurden Positionen identifiziert, welche sensitiv auf Applikationen mit MTS reagierten und folglich zugänglich sind. Die mutmaßliche Anionenbindungsstelle und der Anionentranslokationsweg sind größtenteils in den Transmembrandomänen 3 und 10 lokalisiert. Die hier vorgestellten Daten stimmen mit den aus experimentellen Strukturen abgeleiteten Strukturmodellen überein. Positionen innerhalb der Transmembrandomäne 10 sind hauptsächlich von der intrazellulären Seite zugänglich und Positionen innerhalb der Transmembrandomäne 3 von der extrazellulären Seite. Darüber hinaus gibt es zentrale Positionen im Zebrabärblingprestin, die von beiden Seiten zugänglich sind. Dies deutet auf einen alternierenden Zugang während des Transports (‚alternating-access transport‘) mit einer Aufzugsbewegung (‚elevator movement‘) der Kerndomäne hin. Das Fehlen des extrazellulären Zugangs der homologen Positionen im Rattenprestin zeigt, dass die extrazellulär exponierte Konformation im Säugetierprestin nicht erreicht wird. Dies spricht für einen unvollständigen Transportmechanismus, welchen das Säugetierprestin durchläuft. Die Mutante Rattenprestin V139C ist von beiden Membranseiten zugänglich. Diese zweiseitige Zugänglichkeit spricht für eine Bewegung der Kerndomäne nach außen innerhalb eines unvollständigen Transports. Diese Mutante demonstriert, dass V139 sowohl in der nach innen geöffneten als auch der intermediären (‚occluded‘) Konformation rigide zum Translokationsweg zeigt und keine konformative Umordnung widerfährt. Ein Transport mit abwechselndem Zugang in einer Elevator Weise ist charakterisiert durch eine relative rigide immobile Tordomäne (‚gate domain‘), eine mobile Kerndomäne (‚core domain‘), welche die Anionenbindungsstelle beinhaltet, und eine vertikale Verschiebung des gebundenen Substrates. Das Ergebnis des Scannings unterstützt diese Weise des Transportes, welche ebenfalls für ein prokaryotisches SLC26 Familienmitglied vorgeschlagen wurde. Während Kristallstrukturen ein Protein in einer bestimmten Konformation erfassen, bietet die Cysteinmarkierung die Möglichkeit komplette Konformationsänderungen zu studieren. Das Modell, welches aus den Scanningdaten resultiert, präsentiert alternierende Konformationen, welche durch die extrazelluläre Zugänglichkeit von Positionen des jeweiligen Prestin Orthologs ermittelt wurden. Bis zu welchem Grad sich die Kerndomäne zur extrazellulären Seite öffnet, kann durch die Zugänglichkeit der Positionen V139 innerhalb der Transmembrandomäne 3 des Rattenprestins sowie M400 und S400 innerhalb der Transmembrandomäne 10 des Zebrabärblingprestins hergeleitet werden. Es gibt einen offensichtlichen Unterschied zwischen den alternierenden Konformationen des Prestins der Ratte und des Zebrabärblings. Das Prestin des Zebrabärblings durchläuft einen kompletten Transportzyklus von der nach innen geöffneten bis zur nach außen geöffneten Konformation, wohingegen das Rattenprestin zwischen der innen geöffneten und der intermediären (‚occluded‘) Konformation alterniert. Die Scanningergebnisse zeigen, dass der Elevatortransport primär vom Prestinortholog des Zebrabärblings durchgeführt wird. Das Prestin der Ratte nimmt die nach außen geöffnete Konformation nicht ein und führt dementsprechend einen unvollständigen Transportmechanismus in einer Elevator-ähnlichen Weise durch. Zusätzlich zeigt die Mutante V139C des Rattenprestins eine Kombination aus Mechano- und Redoxsensitivität. Die Aktivität des Rattenprestins V139 ist abhängig von der Applikation eines Fluidstroms. Die Fluss- (‚flow‘-) abhängkeit der Aktivität dieser Mutante scheint mit ihrer Mikroumgebung zu korrelieren – je unflexibler die Seitenkette desto ausgeprägter die Fluss-Abhängigkeit der Aktivität. Basierend auf den hier vorgestellten Daten verursacht der applizierte Fluidstrom keine Membranspannung, sondern Scherspannungen in V139C. Darüber hinaus unterscheidet sich diese Sensitivität von der intrinsischen Spannungssensitivität des Prestin Wildtyps. Letztlich konnte das Phänomen der Mechano- und Redoxsensitivität nicht aufgeklärt werden.