Structural Proteomics of the Fungal Cell Wall

Pilze sind von einer dicken Schicht aus Kohlenhydraten und Proteinen umgeben, die für die Lebensfähigkeit der Zelle essentiell ist – der pilzlichen Zellwand. Proteine sind auf unterschiedliche Arten in dieses Organell integriert: einige sind kovalent an den Kohlenhydratanteil der Zellwand gebunden, entweder über Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker oder alkaliempfindliche Bindungen, andere indirekt über Disulfidbindungen. Zellwandproteine sind an unterschiedlichen zellulären Funktionen beteiligt, wie der Zellwandbiosynthese, der Adhäsion an Oberflächen oder der Sensorik. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die GPI-verankerten Proteine des thermophilen Modellorganismus Chaetomium thermophilum identifiziert. Zunächst wurde eine Vorhersage der an Zellwand und Plasmamembran befindlichen GPI-Proteine durchgeführt. Die Vorhersage wurde durch den massenspektrometrischen Nachweis der GPI-verankerten Zellwandproteine in isolierten Zellwänden ergänzt. Die detektierten Proteine wurden hinsichtlich ihrer Funktionen und mutmaßlichen Rollen analysiert. Interessante Targets für pharmazeutische Anwendungen und Grundlagenforschung konnten ermittelt werden, u. a. Gel1/2, Kre9/Knh1 und Ecm33. Zusätzlich wurde die Ultrastruktur der Zellwand von C. thermophilum mittels Transmissionselektronenmikroskopie analysiert, wobei kurze Mikrofibrillen in der äußeren Zellwandschicht und Ähnlichkeit zu der Zellwand von S. cerevisiae festgestellt werden konnten. Die Arbeit behandelt im zweiten Teil die Analyse der A-Domänen der Candida glabrata Adhäsine Awp1 und Awp3, die Mitglieder des Adhäsinclusters VI sind. Obwohl diesem humanpathogenen Pilz bestimmte Virulenzfaktoren - z. B. zur Hyphenbildung - fehlen, werden C. glabrata Infektionen häufig beobachtet, wobei sein großes Repertoire an Adhäsinen einer der wesentlichen Gründe sein sollte. Awp1A und Awp3A bestehen beide aus einer β-Helix-Domäne und einer α-Kristallin-Domäne. Sie ähneln strukturell kohlenhydratbindenden Proteinen, z. B. Polysaccharid-Lyasen. Allerdings konnte keine Bindung von Kohlenhydraten an Awp1-Typ Adhäsinen nachgewiesen werden. Ein Sequenzähnlichkeitsnetzwerk leitet eine hohe Ähnlichkeit zu den Adhäsinen Awp2 und Awp4 des Adhäsinclusters V ab und untermauert damit frühere Klassifizierungen. Die Strukturen von Awp1 und Awp3 geben erste Einblicke in neue Typen von Adhäsinen in C. glabrata, zu denen Adhäsine der Cluster V und VI gehören. Weiterhin wurde der G-Protein-gekoppelte Rezeptor Pth11 aus C. thermophilum analysiert. Er enthält eine N-terminale CFEM-Domäne - diese Domäne kommt ausschließlich in Pilzzellwand- und Plasmamembranproteinen vor -, die als Ligandenbindungsstelle vorhergesagt wurde. Die CFEM-Domäne von CtPth11 besteht aus fünf α-Helices und weist zwei potenzielle Bindungsstellen auf, die durch F48 geteilt werden. Bestimmte Orientierungen des Aminosäurerestes F48 ermöglichen die Bildung eines Tunnels durch die Domäne. Ein Modell der CtPth11-CFEM-Domäne und der Transmembranregion - basierend auf der Vorhersage benachbarter Reste mittels Sequenzkovarianzanalyse - zeigt, dass beide potenziellen Bindungsstellen zugänglich sind. In einem Fragment-Screen wurden vier Fragmente an der gleichen Bindestelle gebunden; drei davon konnten in die jeweiligen Elektronendichten modelliert werden. Diese hydrophoben Fragmente sind in der hydrophoben Bindestelle platziert und weisen nur wenige zusätzliche Interaktionen auf, was zu der Hypothese passt, dass Pth11 hydrophobe Charakteristika auf der Pflanzenoberfläche wahrnimmt.