Mutational Studies on 17β-HSD14, Serial Synchrotron X-ray Crystallography, Solubility Enhancement using Cyclodextrins and Fragment-Based Drug Discovery Multiple Blocks to Pave the Road of Drug Design

Das erste Kapitel dieser Dissertation (Kapitel 2) präsentiert eine Mutationsstudie, die an der 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ 14 (17β-HSD14) S205-Variante durchgeführt wurde. Dafür wurden fünf Aminosäuren mutiert, von denen man annimmt, dass sie eine wesentliche Rolle bei der Enzymaktivität und dem struckturen Aufbau spielen. Die fünf mutierten Aminosäuren sind: His93Ala, Gln148Ala, Lys158Ala, Tyr253Ala und Cys255Ala. Alle mutierten Aminosäuren befinden sich im aktiven Zentrum des Enzyms (His93, Gln148 und Lys158) oder auf der flexiblen Schleife, die sich über dem aktiven Zentrum befindet (Tyr253 und Cys255). Die Röntgenkristallographie ist die Methode der Wahl, die in dieser Studie verwendet wird, um die Kristallstruktur jeder Variante zu erhalten. Ein nicht-steroidal potenter 17β-HSD14-Inhibitor (Inhibitor 1) wurde in einem Komplex mit dem Wildtyp kristallisiert, der zur Überprüfung der Bindungsfähigkeit des mutierten Enzyms verwendet wurde. Mit jeder Variante wurde ein enzymatischer Assay durchgeführt, um die Aktivität der einzelnen Varianten zu vergleichen. Östrogen (Östradiol) und Androgen (5-Diol) wurden als Substrat im Enzymkinetik-Assay mit NAD⁺ als Co-Faktor verwendet. Der zweite Teil der Arbeit (Kapitel 3) konzentriert sich auf einen neuen Kristallprobenhalter (The Roadrunner I Chip), der in der seriellen Röntgenkristallographie (SSX) eingesetzt wird. Der Roadrunner I-Chip ist ein mikrostrukturierter Probenhalter aus monokristallinem Silizium (Waiver-Technologie) mit Mikroporen. Das Ziel der Verwendung des Roadrunner I-Chips ist es, einen Probenhalter zu haben, der Hunderte bis Tausende von Kristallen dem hochintensiven Röntgenstrahl präsentieren kann, ohne das Beugungsmuster zu stören. In dieser Studie wurde Thermolysin (TLN) als Protein verwendet, um die Grenzen dieser neuen Methode zu testen. Thermolysin-Kristalle wurden bei kryogener Temperatur gezüchtet, gewaschen, in Ligandlösungen eingeweicht und eingefroren, ohne sie vom Chip zu entfernen. Nachdem alle Kristallhandhabungsschritte durchgeführt worden waren, wurden Datensätze von TLN-Kristallen gesammelt, während sie auf dem Chip lokalisiert sind. Der experimentelle Teil dieser Studie wurde am Deutschen Elektronen-Synchrotron (DESY), Hamburg, an der PETRA III P11-Strahllinie in Zusammenarbeit mit assoziierten Labors der Anlage durchgeführt. Der dritte Teil dieser Arbeit (Kapitel 4) befasst sich mit Cyclodextrinen (CDs) und ihrer Fähigkeit, die Löslichkeit hydrophober Verbindungen in wässrigen Lösungen zu verbessern. Das Zielprotein in dieser Studie ist wieder 17β-HSD14. Viele Verbindungen wurden für diese Studie zusammengestellt, wie z.B. eine Fluorverbindungsbibliothek, hydrophobe Medikamente und Sexualhormone. Das Ziel dieser Studie war es, eine Verbindung zu erhalten, die an das Enzym bindet, indem es als Verbindung/CD-Komplex eingeführt wird. Die meisten der in dieser Studie verwendeten Verbindungen wurden bereits mit 17β-HSD14 ohne die Verwendung von CDs getestet, aber aufgrund ihrer geringen Löslichkeit war es nicht möglich, sie in das Enzym einzubringen. Die aus dieser Studie gewonnenen Daten zeigen die Wirkung des Verbindungs-CD/Komplexes, wie er über die Co-Kristallisationsmethode in das Enzym eingebracht wird. Der vierte Teil dieser Arbeit (Kapitel 5) konzentriert sich auf das Fragmentscreening. Eine Bibliothek von 96 Fragmenten wurde mittels Röntgenkristallographie gegen Trypsin gescreent. Diese Studie konzentriert sich auf den Unterschied zwischen den durch das Fragmentscreening erhaltenen Treffern und Teiltreffern. Das Fragmentscreening wurde an zwei Kristallformen (trigonal und orthorhombisch) durchgeführt. Die aus dieser Studie gewonnenen Daten zeigen den Unterschied zwischen den einzelnen Screeningergebnissen und den Einfluss der Packung, der Kristallsymmetrie und der Fragmentabgabe auf die Trefferquote. Viele Aspekte wurden in dieser Studie berücksichtigt, wie z.B. der Unterschied in der Elektronendichte, das Volumen der Bindungstasche, anomale Peaks und Wasserkanäle.