Force required for endocytic vesicle formation analyzed by FRET-based force sensors

Mechanische Kräfte, die von Multiproteinkomplexen ausgeübt werden, sind für viele zelluläre Prozesse unerlässlich. Eines der am besten untersuchten Beispiele ist die Membranumformung während der Clathrin-vermittelten Endozytose, einem Hauptweg des Vesikeltransports, welcher für die molekulare Aufnahme, Signalübertragung und Membranhomöostase verantwortlich ist. Während der Endozytose formt sich ein kleiner Bereich der Plasmamembran von einer flachen Oberfläche zu einem geschlossenen Vesikel um. Diese Einstülpung erfordert mechanische Kraft, welche durch verschiedene endozytotische Proteine und die Polymerisation von Aktin bereitgestellt wird. Bislang wurden verschiedene theoretische Modelle vorgeschlagen, um die Kraftanforderungen der Endozytose zu beschreiben (Lacy et al., 2018). Zum tiefgreifenden Verständnis der kraftabhängigen Bildung endozytotischer Vesikel müssen jedoch die angewandten Kräfte in vivo analysiert werden, um reale Kraftwerte und die wichtigsten beteiligten Faktoren zu ermitteln. Um dies zu erreichen, haben wir FRET (Förster-Resonanzenergietransfer)-basierte Spannungssensoren (Freikamp et al., 2016) verwendet, welche die Messung von Kräften in der Größenordnung von Pikonewton (pN) in vivo erlauben, und diese in das Hefeprotein Sla2 eingefügt. Sla2 ist Teil des essentiellen Proteinlinkers Sla2-Ent1 (Hip1R- epsin 1-3 beim Menschen), der die Kraft des polymerisierenden Aktin-Zytoskeletts während der Endozytose auf die Plasmamembran überträgt (Skruzny et al., 2012, 2015). Durch Verfolgung der über Sla2 vermittelten Kräfte in Echtzeit während verschiedener endozytotischer Vorgänge konnten wir eine Kraft von ca. 10 pN pro Sla2 Molekül ermitteln, was in etwa 450-1330 pN pro endozytotischem Ereignis entspricht. Im Anschluss analysierten wir die Rolle des Aktin-Zytoskeletts und verfolgten die Kraftübertragung in Zellen, in denen der negative Regulator der Aktin-Polymerisation Bbc1 abwesend war. Vor der Vesikelspaltung wurde in diesen Zellen trotz des vergrößerten endozytotischen Aktin-Zytoskeletts weniger Kraft über den Sensor übertragen. Wir schlagen vor, dass ein Überschuss an dichtem Aktingeflecht in bbc1Δ Zellen direkt die lange invaginierende Membran physikalisch umbildet. Zum Abschluss wurde die Kraftübertragung erfolgloser endozytotischer Ereignisse in Zellen verfolgt,denen das BAR-Domänenprotein Rvs167 fehlte. Diese Ereignisse waren gekennzeichnet durch anfängliche Membrankrümmung und anschliessendes Zurückziehen auf ein flaches Membranprofil. Die hier beobachtete gerringe Kraft war ähnlich derjenigen, die bei früher Membrankrümmung in Wildtyp-Zellen gemessen wurde. Dies deutet darauf hin, dass die Stabilisierung der tief invaginierten Membran durch BAR-Domänenproteine wesentlich ist, um eine effektive Kraftübertragung zum Zeitpunkt der Vesikelspaltung zu ermöglichen. Weiterhin analysierten wir die Rolle physikalischer Bedingungen bei kraftabhängigen Schritten der Endozytose. Nach Erniedrigung des hohen Turgordrucks des Hefezytoplasmas, herbeigeführt durch Inkubation der Zellen in hypertonischem Medium, beobachteten wir eine allgemeine Abnahme der für die Membraninvagination erforderlichen Kraft. In ähnlicher Weise reduzierten wir die Spannung der Plasmamembran durch Einlagerung von löslichen Lipiden in die Membran und maßen wiederum eine geringere Kraft, die über den Sla2-Sensor übertragen wurde. Außerdem anaylsierten wir die Kapazität der endozytotischen krafterzeugenden Maschinerie unter hypotonen Bedingungen, welche den Zellturgor erhöhen und damit die Endozytose erschweren sollten. Hierzu setzten wir die Zellen einer Veränderung der osmotischen Bedingungen aus und beobachteten eine Zunahme von arretierten endozytotischen Ereignissen. Eine Analyse der Kraftübertragung der verbliebenen abgeschlossenen Endozytosen ergab Kräfte, welche vergleichbar zu unbehandelten Zellen waren. Die beobachtete partielle Blockierung der Endozytose und die unveränderte Kraftübertragung deuten darauf hin, dass das Aktin-Zytoskelett nur eine begrenzte Kraft für die Endozytose bereitstellen kann. Unserer Ansicht nach werden unsere Daten als Grundlage für ein biomechanisches Modell der endozytischen Vesikelbildung dienen, welches für ein Verständnis der Funktionsweise der endozytischen Maschinerie unter physiologischen und pathologischen Bedingungen unerlässlich ist. Darüber hinaus könnten unsere Daten sehr wertvoll für das Verständnis anderer kraftabhängiger Membranumbauprozesse in der Zelle sein.