Propionyl-CoA Synthase: Characterization, Engineering and Physiological Role of a Trifunctional Fusion Enzyme

Anthropogene Kohlenstoffdioxid (CO2) Emissionen stören das Gleichgewicht im globalen Kohlenstoffzyklus und führen schließlich zur Erderwärmung. Abgesehen von der Funktion als schädliches Treibhausgas, steckt in diesem kleinen Molekül großes Potential als einfache und zugängliche Kohlenstoffquelle. Um dieses Potential jedoch ausnutzen zu können, müssen biotechnologische Strategien entwickelt werden für die Umsetzung von CO2 in höherwertige Produkte, wie Treibstoff oder Antibiotika. Die Identifizierung und Charakterisierung von effizienten Carboxylasen ist daher unabdingbar. Die Familie der Enoyl-CoA Carboxylasen/Reduktasen (Ecr) umfasst die am schnellsten CO2-fixierenden Enzyme, die bisher in der Natur identifiziert wurden. Ihre Effizienz beruht unter anderem auf der erfolgreichen Stabilisierung des CO2-Moleküls im aktiven Zentrum des Enzyms. Das konservierte CO2-Bindungsmotiv ist charakteristisch für Ecrs. Diese Arbeit befasst sich mit der gründlichen Untersuchung des Fusionsenzyms Propionyl-CoA Synthase (Pcs) von Erythrobacter sp. NAP1, welches aus drei Domänen besteht. Die Reduktase-Domäne dieses komplexen Enzyms enthält das CO2-Bindungsmotiv der Ecr Familie, was eine potentielle Aktivität als Carboxylase vermuten lässt und daher genauer untersucht werden soll. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die biochemischen Eigenschaften von Pcs. Anhand kinetischer und struktureller Analysen wurde vorgeschlagen, dass Pcs einen hoch-synchronisierten Katalysemechanismus nutzt, um das Entweichen des reaktiven Zwischenprodukts Acrylyl-CoA zu verhindern. Proteinkristallographie offenbarte eine geschlossene Reaktionskammer, welche alle drei aktiven Zentren des Fusionsenzyms enthält. Somit wird die Katalyse der drei aufeinanderfolgenden Reaktionen im Innern der Kammer ermöglicht. Kinetische Daten stützten die Idee, dass Konformationsänderungen in der Pcs Ligase-Domäne das Öffnen und Schließen der Kammer regulieren. Zusätzliche strukturelle Elemente in Pcs imitieren entweder Domänen benachbarter Protomere in eigenständigen Homologen, welche wesentliche Aminosäurereste zur Katalyse beitragen, oder verschließen die Reaktionskammer. Das vorgeschlagene Carboxylierungspotential der Reduktase-Domäne konnte nachgewiesen werden, wenn auch nur mit sehr geringer Effizienz im Pcs Wildtyp. Rationales Design wurde angewandt, um die zwei Prinzipien der effizienten Carboxylierung, welche aus den Ecrs bekannt sind, in der Reduktase-Domäne der Pcs anzuwenden. Verbesserte CO2-Bindung und Abschirmung des aktiven Zentrums gegen das Einströmen von Wasser überführten die Reduktase-Domäne in eine Carboxylase-Domäne. Die verbesserte trifunktionelle Carboxylase, welche den direkten Transfer reaktiver Zwischenprodukte von einem aktiven Zentrum zum nächsten ermöglicht, könnte sich in einem synthetischen Stoffwechselweg zur CO2-Fixierung als sehr erfolgreich erweisen. Der zweite Teil dieser Arbeit gibt Aufschluss über die physiologische und ökologische Rolle von Pcs. Pcs wurde ursprünglich im Kontext des autotrophen 3-Hydroxypropionat Bizyklus in Chloroflexus aurantiacus entdeckt und detailliert beschrieben. Die Verbreitung des pcs Gens in mehreren (potentiell photo-) heterotrophen Mikroorganismen suggeriert jedoch noch eine alternative Funktion. Im Genomdes aeroben anoxygenen phototrophen Bakteriums Erythrobacter sp. NAP1 sind neben pcs auch alle Gene des 3-Hydroxypropionat-Bizyklus Abschnittes vertreten, um Acetyl-CoA und zwei Bicarbonat-Moleküle in Succinyl-CoA umzuwandeln. Die zwei Schlüsselenzyme Pcs und Malonyl-CoA Reduktase (Mcr) waren in höheren Mengen vertreten, wenn die Zellen bei Licht wuchsen. Folglich wurde vorgeschlagen, dass dieser Stoffwechselweg in der Regulierung eines Redox-Ungleichgewichts beteiligt ist, welches durch photosynthetische Aktivität ausgelöst wird.