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Transkriptionelle Regulation des Escherichia coli-Stoffwechsels und künstlicher Stoffwechselwege
Ein häufiges Problem bei Metabolic-Engineering-Projekten ist es, Enzymkonzentrationen zu finden, die die Produktivität und Effizienz von synthetischen Stoffwechselwegen verbessern. Dieses Problem ist besonders wichtig, wenn heterologe Enzyme überexprimiert werden, die Metaboliten aus dem Zentralstof...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2020
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Ein häufiges Problem bei Metabolic-Engineering-Projekten ist es, Enzymkonzentrationen zu finden, die die Produktivität und Effizienz von synthetischen Stoffwechselwegen verbessern. Dieses Problem ist besonders wichtig, wenn heterologe Enzyme überexprimiert werden, die Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel abführen. Der zusätzliche Bedarf an Metaboliten und Energie verursacht eine Wachstumsbelastung oder führt sogar zum Zelltod (Kapitel 1). Zur Lösung dieses Problems wurden mehrere Strategien angewandt, von denen zwei in dieser Arbeit behandelt werden: i) die entkoppelte Überproduktion mit zweiphasigen Prozessen und ii) die wachstumsgekoppelte Produktion mit einphasigen Prozessen. Ein zweiphasiger Prozess entkoppelt das Wachstum des Wirts von der Produktionsphase, während die einphasige Strategie die Produktion an das Wachstum des Wirts koppelt. In dieser Arbeit werden diese beiden Strategien anhand der Überproduktion von drei Chemikalien als Fallstudien untersucht: Glycerin, Carotinoide und Arginin. Um die zweiphasigen Prozesse zu testen, haben wir Gene der Glycerin-Biosynthese in das E. coli-Genom eingefügt und CRISPR-Interferenz (CRISPRi) zur Herunterregulierung der Expression der RNA-Polymerase verwendet. Wenn das CRISPRi-System bei einer relativ höheren Biomasse induziert wird, kann die Glycerinproduktion gesteigert werden. Dieses Ergebnis impliziert, dass zur Produktion von Glycerin ein bestimmtes Wachstum aufrechterhalten werden muss, anstatt alle Metabolite nur zur Überproduktion zu verwenden (Kapitel 2). Daher ist ein einphasiger Prozess für die Glycerin-Überproduktion vielversprechender.
Um das Konzept der einphasigen Prozesse zu nutzen und mit zusätzlicher Regulierung zu kombinieren, entwarfen wir in Kapitel 3 einen künstlichen Rückkopplungsmechanismus unter Verwendung des Transkriptionsfaktors (TF), Cra. Zu diesem Zweck wurde die Bindesequenz von Cra direkt nach der pBAD-Promotorsequenz eingefügt, welche verwendet wird um Glycerin-Gene zu exprimieren. Dieses Design ermöglichte die native Transkriptionsregulation durch Cra, um die Expression der Glycerol-Gene zu regulieren. Proteom- und Metabolomdaten zeigten, dass das Cra-Regulationssystem die Wachstumsbelastung überwinden kann, indem es die Enzymexpression verlangsamt und dadurch die vollständige Nutzung von Metaboliten verhindert. Diese verzögerte Zeit ermöglichte eine adaptive Reaktion und eine allmähliche Steigerung der Produktsynthese (d.h. Glycerin und Carotinoide). Das beobachtete adaptive Verhalten führt zu einer Erhöhung der Expression von Glukose-Transportern und glykolytischen Enzymen, wodurch die Fitness und Produktivität des Wirts in den Glycerin- und Carotinoid-Überproduktionspfaden verbessert wird. Die Cra-Regulierung wurde bei mehreren Arten von Promotoren, einschließlich pBAD-Promotor, pTetR und konstitutiven Promotoren (Kapitel 4), durchgeführt, was zeigt, dass diese Regulierung eine universelle dynamische Kontrolle ermöglicht.
In Kapitel 5 haben wir GFP genomisch in die intergenische SS9-Region integriert und es als Reportersystem zur Messung von Belastung und Fitnessdefekten verwendet. In diesem System nimmt das GFP-Signal ab, wenn Überproduktionspfade zu viele zelluläre Ressourcen verwenden, weshalb der GFP-Gehalt pro Zelle die zelluläre Fitness widerspiegelt. Darüber hinaus war es empfindlich genug, um die metabolische Belastung auch bei Fehlen eines Wachstumsphänotyps zu erkennen.
In Kapitel 6 kombinieren wir den Arginin-Syntheseweg mit dem CRISPRi-System, um den TF des Stoffwechselwegs, ArgR, herunter zu regulieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine ähnliche Produktivität wie bei einem überproduzierenden ArgR-Deletions-Stamm, aber mit einer weiter verbesserten Wachstumsrate erreicht werden kann. Das Ergebnis zeigt erneut, dass das durch TF-Feedback regulierte System in der Lage ist, die Enzymmenge für eine ausgewogene Ressourcennutzung zu verändern.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Einbeziehung der TF-basierten Regulation in jeden entworfenen Kreislauf den Wirtsstoffwechsel und die Produktion mehrerer hochwertiger Chemikalien ausbalancieren kann, ohne das Wirtswachstum zu verzögern. Dies ist ein Vorteil im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren, das ein komplexes Enzymscreening umfasst, um optimierte Enzymmengen zu erhalten. In dieser Arbeit wird daher eine neue dynamisch gesteuerte Rückkopplungsschleifenstrategie vorgestellt. Mit ihrer Fähigkeit, ein Gleichgewicht zwischen Wirtsstoffwechsel und Produktbildung aufrechtzuerhalten, ohne die Wirtszellen zu belasten, kann diese Strategie nicht nur als wettbewerbsfähige und einfache Lösung zur Verbesserung der Produktivität eines Bakterienstammes dienen, sondern kann auch in großtechnischen Anwendungen weiter ausgebaut werden. |
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| Umfang: | 146 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2020.0485 |