Increasing structural diversity of natural products by enzymatic or nonenzymatic reactions

Sekundärmetabolite sind im Allgemeinen niedermolekulare Verbindungen, die auch als Naturstoffe bezeichnet werden. Bisher wurden in der Natur Millionen von Naturstoffen mit bemerkenswerter struktureller Vielfalt gefunden. Dazu zählen unter anderem, aber nicht ausschließlich, Polyketide, nichtribosomale Peptide, Alkaloide und Terpenoide. Die strukturelle Divergenz von Naturstoffen beginnt mit der Bildung von Grundgerüsten durch verschiedene Rückgratenzyme unter Verwendung grundlegender Bausteine aus dem Primärstoffwechsel. Die Weiterverarbeitungen der Grundstrukturen werden durch modifizierende Enzyme wie Oxidoreduktasen und Transferasen katalysiert, wodurch die Biosynthese von Endprodukten mit großer Vielfalt und Komplexität abgeschlossen wird. Enzyme aus Naturstoffbiosynthesewegen sind aufgrund ihrer hohen Effizienz und Spezifität vielseitige Biokatalysatoren. Die Nutzung des biokatalytischen Potenzials von Enzymen durch chemoenzymatische Synthese hat sich als nützliches Mittel zur Erweiterung chemischer Bibliotheken erwiesen. Neben der enzymatischen Katalyse wurde auch das Auftreten nichtenzymatischer Reaktionen während des postbiosynthetischen Prozesses von Naturstoffen festgestellt. Solche Reaktionen treten häufig unter Beteiligung reaktiver Biosynthesezwischenprodukte auf. Die vollständige Nutzung dieser Zwischenprodukte für die chemische Synthese kann als neuartige Strategie zur Erweiterung der Variabilität von Naturstoffen dienen. In einem Kooperationsprojekt mit Dr. Peter Mai wurden fünf Prenyltransferasen (PTs) der Dimethylallyltryptophan-Synthase (DMATS)-Familie, FtmPT1, BrePT, CdpC2PT, CdpNPT und CdpC3PT, für das Protein-Engineering ausgewählt. Diese PTs katalysieren eine Übertragung regulärer oder reverser Prenylreste (C5) von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) auf die C-2- oder C-3-Position am Indolylring der cyclischen Dipeptide (CDPs). Um ihre Prenyldonorspezifität von DMAPP auf Geranyldiphosphat (GPP) umzustellen, wurden Gatekeeping-Reste durch Sequenzvergleich der fünf PTs mit denen von AtaPT und FgaPT2 identifiziert, nämlich Met364 in FtmPT1, Ile337 in BrePT, Thr351 in CdpC2PT, Met349 in CdpNPT und Phe335 in CdpC3PT. Das Ersetzen dieser Schlüsselaminosäuren durch Glycin führte zur Erstellung von FtmPT1_M364G, BrePT_I337G, CdpC2PT_T351G, CdpNPT_M349G und CdpC3PT_F335G Mutanten. Diese Mutanten zeigten eine deutlich verbesserte Aktivität gegenüber GPP, aber eine verringerte Aktivität mit DMAPP. Daraufhin wurden 42 geranylierte Derivate aus den Inkubationen der erzeugten Mutanten mit 15 getesteten CDPs in Gegenwart von GPP erhalten und deren Strukturen wurden mittels NMR- und MS aufgeklärt. Bei Verwendung von cyclo-L-Trp-L-Trp als Akzeptor und GPP als Donor kann der Transfer von Geranylresten auf alle sieben möglichen Positionen des Indolrings durch die modifizierten Enzyme erreicht werden. Vor unserer Studie wurde nur über eine geringe Anzahl geranylierter Indolderivate berichtet. Diese Studie erhöhte signifikant die strukturelle Vielfalt geranylierter Produkte durch strukturbasiertes Protein-Engineering verfügbarer Dimethylallyltransferasen. In einer Kooperation mit Dr. Jie Fan wurde die Biosynthese von Peniphenon und Penilactonen in Penicillium crustosum PRB-2 aufgeklärt, wobei das Auftreten sowohl enzymatischer als auch nichtenzymatischer Reaktionen während ihrer Bildung festgestellt wurde. Der PKS-NRPS-Hybrid TraA aus dem Terrestric acid-Gencluster ist an der Bildung von Crustosic acid beteiligt, die durch die nicht-Häm-FeII/a-KG-abhängige Oxygenase TraH decarboxyliert und anschließend durch die flavinhaltige Oxidoreduktase TraD zu Terrestric acid reduziert wird. Beide Säuren sind Vorstufen der r-Butyrolactone. Die nicht-reduzierende PKS ClaF aus dem Clavatolcluster ist für die Bildung von Clavatol verantwortlich, das dann durch die nicht-Häm-FeII/a-KG-abhängige Oxygenase ClaD zu Hydroxyclavatol oxidiert wird. Nach spontaner Wasserabspaltung wird Hydroxyclavatol zum reaktiven Intermediat ortho-Chinonmethid (QM) überführt, das durch den nukleophilen Angriff der r-Butyrolactone nichtenzymatische 1,4-Michael-Additionen initiiert. Dies führte zur aufeinanderfolgenden Bildung von Peniphenon D und Penilacton A sowie Penilacton D und B. Zusätzlich zur Verwendung von Enzymen aus natürlichen Biosynthesewegen wurde eine alternative Strategie zur strukturellen Diversifizierung verwendet, indem reaktive Zwischenprodukte aus dem Biosyntheseweg von Naturstoffen genutzt wurden. Wie oben erwähnt, erwies sich das an der Bildung von Peniphenonen und Penilactonen beteiligte ortho-QM als hochreaktiv und ist in der Lage, unter sehr milden Bedingungen spontan mit r-Butyrolactonen zu reagieren. In der folgenden Arbeit wurde die Reaktivität des von Hydroxyclavatol abgeleiteten ortho-QM mit 101 Naturstoffen oder naturstoffähnlichen Verbindungen getestet. Dazu gehören Flavonoide, Hydroxynaphthaline, Cumarine, Xanthone, Anthrachinone, Phloroglucine, Phenolsäuren, Indolderivate, Tyrosinanaloga und Chinoline. Die LC-MS-Analyse ergab eine Produktbildung in den Inkubationen mit 85 getesteten Verbindungen. 32 Clavatol-haltige Produkte wurden aus 23 ausgewählten Inkubationen isoliert und mittels NMR- und MS-Analyse identifiziert. Die Verknüpfungen zwischen den getesteten Nukleophilen und dem ortho-QM aus Hydroxyclavatol erfolgt bevorzugt über C-C-Bindungen an der ortho- oder para-Position von phenolischen Hydroxylgruppen und der C-2-Positionen des Indolrings. Die erhaltenen Produkte wurden auch auf ihre biologischen Aktivitäten getestet. Diese Studie beweist, dass das ortho-QM ein ausgezeichneter Michael-Akzeptor für eine Vielzahl von Substanzen ist, was die Verwendung des reaktiven Biosynthesezwischenprodukts für den Zugriff zur chemischen Vielfalt von Naturstoffen nahelegt.