Implementation of CO2 fixation pathways into Methylorubrum extorquens AM1

Wachstum ist eine Voraussetzung für das Leben und der Stoffwechsel spielt eine zentrale Rolle, um Wachstum zu erreichen und zu erhalten. Seine Funktion besteht in der Konservierung von Energie, die für die metabolischen Reaktionen benötigt wird, sowie in der Umwandlung von Nährstoffen in zelluläre Bausteine, die zur Synthese von Makromolekülen und damit der Zelle selbst dienen. Die in einem Organismus vorhandenen Stoffwechselwege definieren und begrenzen daher seine Wachstumsfähigkeit. Heutzutage kann das zentrale Stoffwechselnetzwerk eines Organismus relativ einfach mithilfe der Gentechnik verändert werden. Die Modifikation biologischer Systeme zur Erweiterung ihres Wachstumspotentials stand im Mittelpunkt dieser Arbeit, wobei der Fokus auf das Alphaproteobakterium Methylorubrum extorquens AM1 gelegt wurde. Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt: 1. Es wurden neuartige induzierbare Promotoren für M. extorquens AM1 auf der Basis des LacI-lacO-Systems entwickelt, die vor der Induktion dicht sind und einen guten dynamischen Bereich aufweisen. Das mit diesen Promotoren erreichte Expressionsniveau übertrifft das des Standard-PmxaF-Promotors, was sie zu den stärksten Promotoren macht, die bisher für diesen Organismus beschrieben wurden. Weiterhin wurden neue extrachromosomale Elemente identifiziert, die als "Mini-Chromosomen" bezeichnet werden und auf repABC-Kassetten basieren, die auch ohne Selektion eine stabile Einheitskopienzahl und eine sichere Vererbung erhalten. Diese neuen DNA-Vehikel sind untereinander und mit dem Broad-Host-(Range-)Plasmid, das bisher für M. extorquens AM1 verwendet wurde, kompatibel. Ein bedingt instabiles Replikon, Mex CM4, zeigte das Verhalten, das zur Etablierung von CRISPR Cas und ähnlichen Techniken erforderlich und für die eine transiente Expression und eine schnelle Auslöschung des Replikons Voraussetzung ist. 2. Der Calvin-Benson-Bassham (CBB)-Zyklus wurde in M. extorquens AM1 zur heterologen CO2-Fixierung eingeführt. Dazu wurde die Kohlenstoffassimilierung aus Methanol unterbrochen, um die Zelle im Einklang mit dem (chemo)organotrophen Wachstum mit Energie zu versorgen. Der Betrieb eines funktionellen CBB-Zyklus wurde mit einer 13C-Tracer-Analyse in dem manipulierten Stamm bestätigt. Darüber hinaus wurde ein positiver Wachstumsphänotyp und eine erhöhte Zellviabilität in Verbindung mit einer funktionellen RubisCO beobachtet. 3. M. extorquens AM1 wurde rational konstruiert und durch serielle Übertragung evolviert, um das Wachstum auf dem neuartigen Substrat Ribose zu verbessern. Mutationen während der gesamten Evolution wurden durch (Re )Sequenzierung des kompletten Genoms identifiziert und genetisch und biochemisch detailliert charakterisiert. Der CBB-Zyklus wurde in die Ribose evolvierten Klone zur gleichzeitigen CO2-Fixierung eingeführt, und Acetat lieferte zusätzliche Energie. Diese Stämme wurden unter semi-chemostatischen Bedingungen weiterevolviert, um die Kohlenstoff-Fixierung über den CBB-Zyklus zu fördern. 4. Die In-vivo-Implementierung eines synthetischen CO2-Fixierungszyklus, des Crotonyl-CoA/Ethylmalonyl-CoA/Hydroxybutyryl-CoA (CETCH)-Zyklus, wurde in M. extorquens AM1 untersucht. Geeignete Enzymkandidaten für jeden Schritt des Crotonyl-CoA-Regenerationsmoduls wurden identifiziert und biochemisch charakterisiert. Diese neuen Kandidaten wurden miteinander kombiniert, um den CETCH-Zyklus zu schließen, und verschiedene M. extorquens AM1 Stämme wurden geschaffen, um wachstumsbasierte Selektionsstrategien zu testen.