Expression and Function of Plexin-B Ligands in the Intestinal Epithelium

Der Gastrointestinaltrakt ist aufgrund seiner Rolle in der Verdauung und Absorption von Nährstoffen und als erste Verteidigung gegen mikrobielle und parasitische Krankheitserreger von zentraler Wichtigkeit. Der Darm ist der längste Abschnitt und erfüllt diese Aufgaben. Sein Epithel ist ein komplexes Gewebe mit diversen Zelltypen, das sich in 4 bis 7 Tagen vollständig erneuert. Um dessen Homöostase zu wahren, müssen Proliferation und Differenzierung im Gleichgewicht sein, wobei die intestinalen Stammzellen eine zentrale Rolle spielen. Wird die Homöostase gestört, entwickeln sich Krankheiten, u. a. kolorektale Tumore, die jährlich 10 % aller neuen Krebserkrankungen ausmachen. Das Semaphorin-Plexin-System besteht aus einer Liganden-Familie, den Semaphorinen und deren Rezeptoren, den Plexinen. Dieses System ist ein Regulator epithelialer Homöostase in anderen Organen, sowie in der Tumorentstehung. Da Plexin B1 und B2 im Darm exprimiert sind, wurde die Expression relevanter Klasse-4-Semaphorin-Liganden, sowie von Angiogenin im Darmepithel systematisch analysiert. Hierbei wurden sich überschneidende Expressionsmuster entdeckt. Weiterhin wurde ein bakterielles artifizielles Chromosom konstruiert, um Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des enterozyten-spezifischen Alpi-Promotors zu exprimieren. Dieses Konstrukt ermöglichte die Zucht eines neuen Alpi-Cre Mausstamms, mit dem Ziel, zukünftig enterozyten-spezifische Knockout-Mäuse zu generieren. Die Funktion intestinaler Stammzellen wurde analysiert, indem Darmkrypten von Plexin B1/B2 Doppelknockout-Mäusen isoliert und in Kultur genommen wurden. Deren reduzierte Fähigkeit, Organoide auszubilden, wies auf einen Defekt der Stammzell-Funktion hin. Semaphorin-Knockout-Organoide wurden analysiert, um die zugehörigen Liganden zu identifizieren, replizierten den Phänotyp des Rezeptor-Knockouts allerdings nicht. Zudem wurde die lentivirale Transduktion von Organoiden etabliert, um mittels RNAi die Expression mehrerer Liganden gleichzeitig reduzieren zu können. Ferner wurden Kolon-Organoide aus gesundem Gewebe und Tumorproben von Patienten etabliert, um die Funktion der Semaphorine in menschlichem Darmepithel und dessen Erkrankungen zu untersuchen. Diese Ergebnisse zeigen überlappende Expressionsmuster der B-Plexin-Liganden im Darm, legen deren Redundanz dar und ermöglichen weitere funktionelle Experimente, inklusive der Untersuchung des menschlichen Darmepithels.