Realization of a New-to-Nature Carboxylation Pathway

Der größte Teil des anorganischen Kohlenstoffs gelangt über den Calvin-Zyklus durch das Schlüsselenzym Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/-oxygenase (RuBisCO) in die Biosphäre. Eine unproduktive Nebenreaktion von RuBisCO mit Sauerstoff führt zur Bildung von 2-Phosphoglykolat (2-PG), das über komplexe Reaktionen in 3-Phosphoglycerat (3-PGA) zurückgeführt wird, wobei Kohlendioxid freigesetzt wird. Der Tartronyl-CoA-Weg stellt einen synthetischen Stoffwechselweg dar, der entwickelt wurde, um 2-PG effizienter zu recyceln, die Freisetzung von Kohlendioxid zu vermeiden und stattdessen Kohlendioxid zu fixieren. Er besteht aus vier Hauptreaktionsschritten, von denen nicht bekannt ist, dass sie an natürlichen Stoffwechselwegen beteiligt sind. Diese Schritte sind die Aktivierung von Glykolat zu Glykolyl-CoA, die Carboxylierung von Glykolyl-CoA zu Tartronyl-CoA als Schlüsselreaktion und die nachfolgenden zwei Reduktionen, die zu Glycerat führen. In dieser Arbeit wurden alle erforderlichen Enzyme identifiziert oder durch Engineering etabliert und der Tartronyl-CoA-Weg in vitro realisiert. Enzymkandidaten, die anologe Reaktionen mit ähnlichen Substraten katalysieren, wurden getestet und weiter verbessert, um die gewünschten Reaktionen zu katalysieren. Dazu gehören die engineerten Glykolyl-CoA-Synthetase und Glykolyl-CoA-Carboxylase (GCC) sowie eine Tartronyl-CoA-Reduktase. Für das Engineering von GCC wurde rationales Design sowie Hochdurchsatz-Screening von Varianten angewendet. Dies führte zu einer neuen Carboxylase, die den kinetischen Eigenschaften natürlicher Carboxylasen entspricht. Darüber hinaus wurde eine Kryoelektronenmikroskopie-Struktur von GCC mit einer Auflösung von 1,96 Å erhalten, die die Auswirkungen der eingeführten Mutationen hervorhebt und bestätigt. Die konzertierte Funktion aller Enzyme des Tartronyl-CoA-Weges wurde im Kontext von Photorespiration in vitro bestätigt. Die In-vitro-Rekonstitution umfasste auch die Optimierung der Reaktionsparameter sowie ein effizientes Cofaktorrecycling. Neben seiner Funktion als photorespiratorischer Bypass funktioniert der Tartronyl-CoA-Weg als zusätzliches Kohlenstoff-Fixierungsmodul, das einen synthetischen Kohlendioxid-Fixierungszyklus mit dem zentralen Kohlenstoffmetabolismus verbinden kann. Darüber hinaus wurde der Tartronyl-CoA-Weg erfolgreich für die In-vitro-Umwandlung von Ethylenglykol (ein Bestandteil von Kunststoffabfall) zu Glycerat eingesetzt. In einem ersten Versuch einer In-vivo-Implementierung des Tartronyl-CoA-Weges zur Ethylenglykol-Assimilation wurde gezeigt, dass GCC, das Schlüsselenzym des Tartronyl-CoA-Weges, in Pseudomonas putida funktionell hergestellt werden kann.