Molecular and biochemical investigations of genes and enzymes involved in the phenolic metabolism of the hornwort Anthoceros agrestis

Eine wichtige Gruppe pflanzlicher Inhaltstoffe sind phenolische Verbindungen, welche zu vielen unterschiedlichen Sekundärmetaboliten umgewandelt werden können, z.B. Flavonoiden, Lignanen und Lignin, Cutin und Suberin sowie Hydroxyzimtsäureestern und -amiden (z.B. Chlorogensäure und Rosmarinsäure). Diese Substanzen können zum Beispiel als natürlicher Sonnenschutz oder als Zellwandverstärkung dienen, welche für das Leben oberhalb der Wasseroberfläche unerlässlich sind [1]. Unter den Bryophyten waren die Hornmoose bisher die einzige Abteilung, bei der es keine Informationen über den Phenylpropanoid-Stoffwechsels auf genomischer Ebene gab [2, 3]. Die Zimtsäure 4-Hydroxylase aus Anthoceros agrestis wurde heterolog in Escherichia coli und Physcomitrella patens exprimiert. Zur Expression in E. coli wurde AaC4H mit AaCPR, einer NADPH:Cytochrom-P450-Reduktase, fusioniert. Das resultierende Fusionsprotein produzierte nur eine geringe Menge an 4-Cumarsäure. Zusätzlich lag AaCPR als lösliches Protein vor und konnte daher nach Aufreinigung über Affinitätschromatographie charakterisiert werden. P. patens wurde als geeigneter Expressionswirt pflanzlicher CYPs vorgestellt. In RT-qPCR Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Expression von AaC4H zwischen 270 bis 3700-fach im Vergleich zu zwei potentiellen C4Hs aus P. patens war. Extrakte aus transformierten Kulturen zeigten die Bildung der doppelten bis dreifachen Menge an 4-Cumarsäure und erhöhten die Affinität für Zimtsäure im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle. Mit einer 4-Cumarat CoA-Ligase (Aa4CL) und einer 4-Hydroxybenzoat CoA-Ligase (Aa4HBCL) wurden zwei Enzyme entdeckt, welche in der Lage waren, verschiedene Zimtsäure- und Benzoesäurederivate zu aktivieren. Dabei unterschieden sich beide erheblich in ihrer Substratpräferenz. Aa4CL aktivierte ausschließlich (Hydroxy-) Zimtsäuren, akzeptierte aber keine Sinapinsäure. Aa4HBCL aktivierte vorzugsweise Benzoesäure, monohydroxylierte Benzoesäuren und viele andere Benzoesäurederivate (außer Salicylsäure, 3-Aminosalicylsäure und Vanillinsäure), zeigte aber auch Aktivität mit (Hydroxy-)Zimtsäuren (außer Ferulasäure und Sinapinsäure). Neben Aa4CL und Aa4HBCL wurde eine dritte potenzielle CoA-Ligase in E. coli exprimiert. Die Aminosäuresequenz von Aa20832 zeigte eine peroxisomale Signalsequenz (PTS1) und zwei potenzielle Transmembran-Helices. Das Protein aktivierte weder (Hydroxy-)Zimtsäuren noch (Hydroxy-)Benzoesäuren, zeigte aber eine hohe ATPase-Aktivität. Es konnte nicht eindeutig nachgewiesen werde, ob Aa20832 eine Aktivität gegenüber Fettsäuren aufweist. Ein weiteres in dieser Arbeit charakterisiertes Enzym war AaCYP98, eine Hydroxycinnamoylester/amid 3-Hydroxylase. Eine native AaCYP98 wurde in P. patens exprimiert und eine Codon-optimierte Sequenz der AaCYP98 in S. cerevisiae. AaCYP98 war in der Lage, 4-Cumaroyl-3'-Hydroxyanthranilat, 4-Cumaroylanthranilat, 4-Cumaroyltyramin, 4-Cumaroylshikimat und 4-Cumaroyl-4'-Hydroxyphenyllactat zu hydroxylieren, nicht jedoch 4-Cumaroylchinat, 4-Cumaroyl-2'-Threonat und Caffeoyl-4'-Hydroxyphenyllactat. Da diese Substrate nicht kommerziell erhältlich waren, wurden die meisten von ihnen entweder aus pflanzlichen Zellkulturen isoliert oder enzymatisch sowie chemisch synthetisiert. Durch Koexpression einer CPR aus Coleus blumei konnte die Aktivität der AaCYP98 13-fach gesteigert werden. Das Cytochrom P450 Enzym AaAp626 wurde in P. patens exprimiert. In einer BLASTp-Suche zeigte die Sequenz die höchste Identität gegenüber putativen Flavonoid 3'-Hydroxylasen und CYP71A1. In Enzymtests mit verschiedenen Substraten konnte aber keine Aktivität beobachtet werden. Daher bleibt die Funktion dieses Proteins ungewiss. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit die beiden letzten Enzyme des zentralen Phenylpropanoid-Stoffwechsels (AaC4H und Aa4CL), Enzyme nachfolgender Biosynthesewege (AaCYP98 und Aa4HBCL) sowie eine NADPH-abhängige CPR (AaCPR) aus dem Hornmoos Anthoceros agrestis identifiziert und charakterisiert. Darüber hinaus wurden zwei Proteine mit noch unbekannter Funktion, ein CYP und eine weitere CoA-Ligase, heterolog in P. patens und E. coli exprimiert. Diese Ergebnisse bieten eine gute Grundlage, um einen tieferen Einblick in die Funktion und Evolution des pflanzlichen Phenylpropanoid-Biosynthesewegs zu gewinnen. [1] Rensing (2018) Current opinion in plant biology 42: 49-54 [2] de Vries et al. (2017) Plant and Cell Physiology 58: 934-945 [3] Renault et al. (2019) Current opinion in biotechnology 56: 105-111