Biosynthesis of penilactones and peniphenones in Penicillium crustosum

Die von Pflanzen, Bakterien und Pilzen stammenden Sekundärmetabolite bilden eine große Gruppe von Verbindungen, die nicht direkt mit dem Wachstum, der Entwicklung und der Vermehrung des Organismus zusammenhängen. Seit der Entdeckung des Penicillins im Jahr 1928 sind Mikroben, v.a. Pilze und Bakterien, wichtige Quellen für Naturstoffe. Durch verbesserte Isolierungs- und Charakterisierungsmethoden konnten diverse Sekundärmetabolite verschiedener Gruppen, wie z. B. Polyketide, nicht-ribosomale Polypeptide, Alkaloide und Terpene aus biologischen Proben identifiziert werden. Die Produzenten verwenden eine begrenzte Anzahl von Bausteinen aus dem Primärstoffwechsel, um verschiedene Naturstoffgerüste zu konstruieren. Diese können durch weitere Enzyme modifiziert werden, um eine Vielzahl von Endprodukten herzustellen. Eine Polyketid-Kernstruktur, die durch eine oder mehrere Polyketidsynthasen (PKSs) aus Acyl-CoAs zusammengebaut wird, kann durch eine Reihe von Enzymen, wie z.B. nonheme-FeII/2-OG-abhängige Oxygenasen, flavin-haltige Oxidoreduktasen, Cytochrom P450s und Prenyltransferasen modifiziert werden, so dass eine erstaunliche Vielfalt von Naturstoffen erzielt wird. Um die Biosynthese von Naturstoffen aufzuklären werden verschiedene Methoden, wie z.B. die Bioinformatik oder molekularbiologische und biochemische Verfahren angewandt. Somit können Funktionen der kodierenden Gene, die sich normalerweise zusammen in einem biosynthetisches Gencluster (BGC) befinden, genau untersucht werden. Dennoch können auch nicht-enzymatische Reaktionen nach der Biosynthese an der Naturstoffentstehung beteiligt sein. In dieser Arbeit wurde die Sekundärmetabolit-Biosynthese in einem Pilzstamm, Penicillium crustosum PRB-2, in Zusammenarbeit mit Ge Liao untersucht. Penilactone A, B und D sowie Peniphenon D, die strukturell Clavatol- und r-Butyrolacton-Einheiten enthalten, wurden in dem Wildtyp identifiziert. Zwei unterschiedliche DNA-Abschnitte wurden durch Geninaktivierung in dem PRB-2-Stamm, heterologe Expression in Aspergillus nidulans und Fütterungsexperimente in den Deletionsmutanten als verantwortliche Gencluster für die Produktion von Penilactone und Peniphenone identifiziert. Die nicht-reduzierende (NR) PKS ClaF aus dem Clavatol-Cluster ist für die Bildung von Clavatol verantwortlich. Die hybride PKS-NRPS TraA aus dem Terrestric acid-Cluster ist an der Biosynthese von Crustosic acid und Terrestric acid beteiligt, indem eine Spaltung der C-C-Bindung unter Bildung von r-Butyrolactonen stattfindet. Die Oxidation von Clavatol zu Hydroxyclavatol durch die nonheme-FeII/2-OG-abhängige Oxygenase ClaD und dessen spontane Dehydratisierung zu einem Orthochinon-methid-Intermediat initiieren eine nicht enzymatische 1,4-Michael-Addition zu r-Butyrolacton. Die Kreuzkupplung dieser zwei Einheiten aus zwei getrennten Genclustern führt zur Bildung von Peniphenon D und Penilacton D , die eine zweite Michael-Addition mit Orthochinonmethid zur Bildung von Penilacton A und B eingehen. Die verwendeten Strategien wurden anschließend mit detaillierten Untersuchungen zur Biosynthese von Terrestric acid erweitert. Es wurde gezeigt, dass die hybride PKS-NRPS TraA und die Enoylreduktase TraG für die Entstehung der Carboxycrustic acid und Viridicatic acid mit der Tetronat-Grundstruktur als Vorläufer von Crustosic acid in Penicillium Crustosum PRB-2 verantwortlich sind. Biochemische Charakterisierungen haben gezeigt, dass die Umwandlung von Crustosic acid in Terrestric acid durch eine oxidative Decarboxylierung von der nonheme-FeII/2-OG-abhängigen Oxygenase TraH und die anschließende stereospezifische C-C-Doppelbindungsreduktion von der Flavin-haltigen Oxidoreduktase TraD erfolgte. Ein Reaktionsmechanismus mit FeIV=O-Intermediaten wurde für die TraH-katalysierte Olefinierung mit oder ohne CO2-Eliminierung postuliert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass komplexe Strukturen von Genen aus zwei getrennten Clustern hergestellt und enzymatische und nicht-enzymatische Reaktionen involviert werden können. Die Ergebnisse zur Biosynthese von Terrestric acid liefern auch eine solide experimentelle Grundlage für die Entstehung pilzlicher Acyltetronate mit unterschiedlicher Stereochemie. Neben Penilatonen und Peniphenonen sind weitere clavatol-haltige Naturstoffe bekannt. Wir vermuten, dass diese Verbindungen höchstwahrscheinlich auch durch den nucleophilen Angriff von aus Hydroxyclavatol stammendem Orthochinonmethid synthetisiert werden. Diese Hypothese hat unser Interesse geweckt, die Reaktivität von Orthochinonmethid mit verschiedenen Naturstoffen zu untersuchen. Von 102 getesteten Substanzen führte die Coinkubation mit Hydroxyclavatol unter milden Bedingungen in 86 Fällen zu nachweisbaren Clavatol-Kupplungsprodukten. Nach Isolierung und Strukturaufklärung wurden 32 neue clavatol-haltige Verbindungen identifiziert. Die Konjugationen zwischen Clavatol und den Nucleophilen erfolgt hauptsächlich mit Bildung einer C-C-Bindung an den para- oder ortho-Positionen der Hydroxyl-/Aminogruppe am Benzolring sowie der C2-Position des Indolrings. Diese Studie bestätigte die Reaktivität des aus Hydroxyclavatol spontan entstandenen Orthochinonmethids in einem wässrigen System und erhöhte die Vielfalt der clavatol-haltigen Produkte in Natur.