Characterization of the Hemagglutinin Cleaving Transmembrane Serine Proteases Matriptase and TMPRSS2

Matriptase und TMPRSS2 sind humane Transmembran Serinproteasen, die in der Lage sind, verschiedene Subtypen des Influenza-A Oberflächenproteins Hemagglutinin proteolytisch zu spalten und somit die Vermehrung von Influenzaviren in der Wirtszelle ermöglichen. Die Charakterisierung dieser Wirtsproteasen ist eine wichtige Voraussetzung zur Entwicklung wirksamer und selektiver Inhbibitoren als potentielle Wirkstoffe zur Therapie von Influenzainfektionen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Expressionssystem zur Herstellung rekombinanter C122S mutierter Matriptase etabliert und das erhaltene Protein im Folgenden für die enzymkinetische Charakterisierung verschiedener Inhibitoren sowie zur Strukturanalyse eingesetzt. Des Weiteren wurden verschiedene verkürzte und/oder mutierte TMPRSS2 Formen hergestellt und auf ihre proteolytische Aktivität mit dem Ziel untersucht, eine isolierbare TMPRSS2 Variante für enzymkinetische Messungen bereit zu stellen. In dem Wirtsorganismus E. coli wurden zwei verschiedene Matriptasevarianten produziert und miteinander enzymkinetisch verglichen. Die Serinproteasedomänen der Wildtyp-Matriptase und der mutierten C122S-Matriptase wurden jeweils mit 6 verschiedenen AMC-Substraten vermessen und zeigten dasselbe enzymkinetische Profil. Die etwas schlechteren Ausbeuten bei der Produktion der C122S-Matriptasevariante wurde durch die deutlich kostengünstigere Herstellung kompensiert. Im Folgenden wurden größere Mengen der C122S-Matriptase produziert und für Kristallisationationsexperimente eingesetzt. Durch den Einsatz der Hochdurchsatz Kristallisationsrobotik konnte ein geeigneter Kristall zur Sturkturanalyse gefunden werden. Mittels „Micoseed Matrix Screening“ konnten in einem zweiten Ansatz 4 weitere gut geformte Matriptase Proteinkristalle erhalten werden, indem zwei für die Röntgenstrukturanalyse qualitativ nicht geeignete und zerkleinerte Proteinkristalle dem neuen Kristallisationsansatz beigefügt wurden. Im Fokus der Entwicklung neuer monobasischer 3-Amidinophenylalanin Derivate im Rahmen dieser Arbeit standen potente Matriptase Verbindungen die eine hohe Selektivität gegenüber den Serinproteasen der Blutgerinnungskaskade Faktor Xa und Thrombin aufweisen. Insgesamt wurden 18 monobasische und somit potentiell bioverfügbare, als auch 4 dibasische Verbindungen getestet. Auf Basis einer Kristallstruktur der Matriptase in Komplex mit einem Inhibitor des 3-Amidinophenylalanin-Typs (PDB code: 2GV6, Verbindung 20) wurde Docking genutzt um mögliche Optimierungen des N-Terminus zu identifizieren. Es wurden Verbindungen mit einer 3-Hydroxymethylgruppe ausgesucht, da eine Interaktion mit dem Gln175 der Matriptase vorhergesagt wurde, die zu einer erhöhten Matriptase Affinität, aber nicht fXa Affinität, beitragen soll. Die monobasische Verbindung 55 mit einem 4-tert-Butylureido Piperidin am C- und 3-Fluor-4-Hydroxymethyl Biphenylsulphonyl am N-Terminus zeigte eine hervorragende Selektivität gegenüber Thrombin (1533-fach). Der kristallographische Bindemodus dieser Verbindung in Komplex mit Matriptase zeigte eine Interaktion der 4-Hydroxymethylgruppe mit dem Gln175, was zu einer moderaten Selektivität gegenüber fXa führte (12-fach). Der Bindemodus von Verbindung 55 (als auch Verbindung 56) wurde zudem in Komplex mit Trypsin bestimmt. Das gut verfügbare Trypsin erwies sich als geeignete Alternative zu Matriptase, wenn eine Interaktion des Inhibitors mit der S3/4 Bindetasche im Fokus steht. Der Inhibitor C-Terminus zeigte dagegen eine abweichende Orientierung in beiden Proteasen. Die Trypsin/Verbindung 56-Kristallstruktur zeigte außerdem, dass ein N-terminales 3-Hydroxymethyl theoretisch mit dem Gln175 in Matriptase interagieren würde. Verbindungen mit einem 3-Hydroxymethyl zeigten allerdings eine verminderte Matriptase Affinität (als auch Selektivität) in enzymkinetischen Messungen. Aufgrund erfolgloser Isolierversuche aktiver TMPRSS2 aus E.coli Bakterien wurden verschiedene Strategien entwickelt um die anspruchsvolle Transmembran Serinprotease aus Säugerzellen zu isolieren. Dazu wurden zunächst verkürzte als auch mutierte TMPRSS2-Varianten eingesetzt um strukturelle Eigenschaften zu identifizieren, die essentiell für eine Proteaseaktivität sind. Die Hauptstrategie basierte auf dem Entfernen von mindestens der Transmembrandomäne um löslisches und somit leichter isolierbares Enzym zu erhalten. Obwohl im Rahmen dieser Thesis keine aktive TMPRSS2 isoliert wurde, konnten durch diese Versuche neue Erkenntnisse zur TMPRSS2 Funktionalität gewonnen werden. Es wurde gezeigt, dass der zytosolische Teil, die Transmembrandomäne als auch die LDLRA Domäne keine Voraussetzung zur autokatalytischen Aktivierung von TMPRSS2 sind. Die SRCR Domäne als auch die Disulfidbrücke, welche die Proteasendomäne mit der Stammregion nach der Aktivierungsspaltung verbindet, sind hingegen essentiell für TMPRSS2 Aktivität in der Zelle. Trotz Entfernung der in der Zellmembran verankernden Transmembrandomäne konnte in Immunofluoreszens-Versuchen keine offensichtliche Dislokalisation der verkürzten Varianten im Vergleich zum Wildtyp festgestellt werden. Des Weiteren wurde TMPRSS2 in vitro als ein Substrat der Matriptase identifiziert. Dies deutet auf die Involvierung von TMPRSS2 in mehreren Zymogenkaskaden hin.