Studying Large Multi-Protein Complexes Using Single Molecule Localization Microscopy

Die Biologie wäre heute nicht, wo sie ist, ohne die Fluoreszenzmikroskopie. Sie ist unbestreitbar eines der am häufigsten verwendeten Werkzeuge im Repertoire des Biologen und es hilft Wis- senschaftlern seit Jahrzehnten, die Lokalisation von Zellproteinen und anderen kleinen Strukturen zu untersuchen. Sie ist aber nicht ohne Limitationen. Aufgrund des Abbe-Limits ist die Fluo- reszenzmikroskopie beschränkt auf Strukturen im Mikrometerbereich. Die Naturwissenschaften haben sich lange auf die Elektronenmikroskopie und Röntgenkristallographie verlassen, um Phänomene unterhalb dieses Limits zu studieren. Allerdings gibt es viele Prozesse, welche sich zwischen diesen beiden räumlichen Domänen ereignen. Superauflösende Mikroskopie, der nächste Schritt in der Evolution der Fluoreszenzmikroskopie, hat das Potential, den Bereich zwischen mikro und nano zu überbrücken. Sie kombiniert höhere Auflösungen von bis zu wenigen Nanometern mit der Fähigkeit, Objekte in ihrer natürlichen Umgebung zu beobachten. Sie ist das ideale Werkzeug, um grosse Multiproteinkomplexe zu untersuchen, welche die meisten Funktionen des Lebens ausführen, aber zu komplex und fragil für die Elektronenmikroskopie oder Kristallographie sind. Eine Form der superauflösenden Mikroskopie, genannt SMLM, ist diesbezüglich sehr vielver- sprechend. Mit ihrer Fähigkeit, individuelle Moleküle zu detektieren, kombiniert sie die hohe Auflösung für strukturelle Studien mit der quantitativen Auslesung für den Erhalt von Stö- chiometrien von Multiproteinkomplexen. Diese Thesis beschreibt neue Werkzeuge, welche das Repertoire von SMLM erweitert mit dem spezifischen Ziel, Multiproteinkomplexe zu untersuchen. Als erstes, die Entwicklung eines neuen fluoreszierenden tagging Systems, das eine Mischung ist aus genetischem Tagging und Immunofärbung. Das System, bezeichnet als BC2, besteht aus einem kurzen, genetisch codierbaren Peptid, das von einem Nanobody (BC2 nanobody) anvisiert werden kann. Dieses System bring mehrere Vorteile. Das kleine Tag stört das Protein, an welches es befestigt ist, nicht und der kleine Nanobody kommt in enge Räume rein, was es zu einem exzellenten Tag für dichte Multiproteinstrukturen macht. Als nächstes, mehrere neue Varianten von oft verwendeten grün-zu-rot fluoreszierenden Pro- teinen. Diese neuen Varianten, welche mit einer Kombination von blauem und infrarotem Licht konvertiert werden können, sind besonders nützlich für Lebendzellmikroskopie. Die entwickelten fluoreszierenden Proteine können auch mit photo-aktivierbaren fluoreszierenden Proteinen kombiniert werden, um das Mikroskopieren von mehreren Zielstrukturen mit derselben Farbe zu ermöglichen. Zuletzt, eine Applikation dieser letztgenannten Technik, um den Multiproteinkomplex des Kine- tochors zu untersuchen und erste Einsichten in seine Architektur und räumliche Organisation zu erhalten, ebenso wie zur Stöchiometrie seiner Untereinheiten.