Structural base for the transfer of GPI-anchored proteins into fungal cell walls

Pilze, wie der einzellige Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae, besitzen eine Zellwand aus Polysacchariden und Proteinen, die für lebensfähige und gesunde Zellen essentiell ist. Während die Synthese ihrer Komponenten entlang des sekretorischen Weges und an der Plasmamembran erfolgt, wird die korrekte Verarbeitung auf der Außenseite der Plasmamembran bewerkstelligt. Dies wird durch sogenannte Glykosidhydrolasen (GH), realisiert, welche die Spaltung und Neuverknüpfung von glykosidischen Bindungen katalysieren. In S. cerevisiae und dem Humanpathogen Candida albicans wurde gezeigt, dass Mitglieder der GH76-Familie (Dfg5-Subfamilie) für den Einbau von GPI-verankerten Proteinen in die Zellwand verantwortlich sind, ein Vorgang, der für Hefen überlebenswichtig ist. Obwohl bakterielle Homologe dieser Klasse bereits beschrieben wurden, sind die zugrunde liegenden Mechanismen der pilzlichen Vertreter, trotz ihres außergewöhnlichen Potenzials als Wirkstoff Zielstruktur, noch immer unbekannt. Um diese Lücke zu schließen, wurde die GH76-Familie zunächst einer phylogenetischen Analyse unterzogen, die Einblicke in ihren multifunktionalen Charakter gewährte. Die genaue Rolle der Dfg5-Proteine konnte durch Struktur- und Funktionsanalysen des Orthologs CtDfg5 aus dem thermophilen Schimmelpilz Chaetomium thermophilum erklärt werden. Seine mit atomarer Auflösung bestimmte Kristallstruktur zeigte, dass die Faltung und das aktive Zentrum zwischen Pilz- und Bakterienhomologen konserviert ist, jedoch war es nicht möglich die bekannte α1,6-Mannanaseaktivität in vitro zu zeigen. Stattdessen konnte die GPI-Glykanstruktur (Manα1,2-Manα1,6-Manα1,4-GlcN) innerhalb der Bindetasche von CtDfg5 durch hochmolares Zuckerfragmentscreening assembliert werden. Dies ermöglichte nicht nur einen detaillierten Blick auf das tatsächliche Substrat der Dfg5-Proteine, sondern auch erste experimentell abgeleitete Erkenntnisse über die dreidimensionale Architektur des GPI-Ankerglykans. Zusammen mit der Struktur eines potentiellen Akzeptormoleküls konnte der von Dfg5-Proteinen katalysierte Lipid-zur-Zellwand-Transfermechanismus abgeleitet werden. Darüber hinaus ermöglichten die strukturellen Einblicke in die Substratkoordinierung eine mögliche Lenkungsfunktion verschiedener GPI-Modifikationen, mit deren Hilfe die endgültige Lokalisation von GPI-verankerten Proteinen kodiert wird. Außerdem konnte durch Docking eine Leitstruktur (FP-1) identifiziert werden, das im aktiven Zentrum von CtDfg5 bindet. FP-1 zeigt spezifische Effekte bei millimolaren Konzentrationen in Bezug auf die Lebensfähigkeit von S. cerevisiae. Schließlich wurde, durch die strukturelle Charakterisierung eines pilzlichen Homologs aus einer weiteren GH76-Unterfamilie, α1,6-Mannobiose als zentrales Element von GH76-Substraten identifiziert.