Investigating and manipulating the reaction mechanism of reductive carboxylases

Effiziente Abscheidung und Umwandlung von atmosphärischen Kohlenstoffdioxid (CO2) ist eine Voraussetzung für die Entwicklung einer zukünftigen Kohlenstoff-neutralen Resourcenvewertung. Kohlenstofffixierung ist der Prozess wodurch anorganischer Kohlenstoff in Biomasse eingebaut wird. Carboxylasen sind natürlich vorkommende Enzyme welche in der Lage sind atmosphärisches Kohlenstoffdioxid unter milden Bedingungen in organische Verbindungen einzubauen. Jedes Jahr werden circa 400 Gt CO2 alleine von Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO), das Schlüsselenzym der Photosynthese, fixiert. Verglichen dazu, Verwendet die chemische Industrie nur 0.1 Gt CO2 pro Jahr und zusätzlich benötigen diese Prozesse einen hohen Druck und Temperaturen. Deshalb ist es notwendig mehr Wissen über die molekularen Mechanismen zu erhalten, welche es Carboxylasen erlauben mit CO2 unter atmosphärischen Konzentrationen (0.04% vol) zu interagieren. Enoyl-CoA Carboxylasen/Reductasen (ECRs) sind die schnellsten Carboxylasen die heutzutage bekannt sind und sind zusätzlich, im Vergleich zu RuBisCO, spezifisch für CO2. Diese katalysieren die reduktive carboxylierung von Enoyl-CoAs mit der Oxidation von NADPH. Deshalb stellen ECRs ein gutes Modellsystem dar um die CO2 Chemie von Carboxylasen zu studieren. In dieser Arbeit, versuchen wir mehr Wissen über die grundlegenden katalytischen Prinzipien zu erlangen wodurch ECRs hohe Umschlagszahlen erreichen. Im ersten Kapitel steht die Interaktion zwischen CO2 und den Aminosäuren im Aktiven Zentrum von ECRs im Vordergrund. Es wurden vier konservierte Aminosäuren identifiziert und für jede eine Funktion zugeschrieben. Die Seitenketten von drei Aminosäuren sind verantwortlich um CO2 genau zu positionieren damit der nucleophile Angriff vom Enolat Intermediat stattfinden kann. Eine vierte Seitenkette ist verantwortlich das Aktive Zentrum vor Wasser zu schützen sodass das Enolat Intermediat nicht irreversibel protoniert wird. Diese sind die Zwei grundlegenden katalytischen Prinzipien wodurch ECRs eine effiziente Carboxylierung katalysieren. Im Anschluss wird in einem Kapitel beschrieben, ob es möglich ist, dass ECRs zusätzlich zu CO2, andere Elektrophile inkorporieren können. Wir zeigen, dass ECRs Formaldehyd verwenden und somit ein beta-hydroxy Thioester bilden können. Die exzellente Stereospezifizität und die große Vielfalt an kleinen elektrophilen Verbindungen machen ECR zu einem potentiellen Biokatalysator für die Produktion von α-substituierten Thioestern. In den letzten beiden Kapiteln dieser Arbeit werden strukturelle Eigenschaften von ECRs betrachtet. Vier neue Kristallstrukturen der ECR von Kitasatospora setae wurden gelöst und ein neuer katalytischer Zyklus für dieses Enzym vorgeschlagen. Wir haben gezeigt, dass die Kommunikation zwischen, und innerhalb der Dimere welche das funktionelle Homotetramer bilden, die Grundlage für eine schnelle Katalyse darstellt. Im letzten Kapitel versuchen wir eine in vivo gerichtete Evolution Strategie zu entwickeln um die katalytischen Parameter einer ECR von Burkholderia ambifaria zu verbessern. Mit dieser Methode haben wir eine evolvierte ECR Variante erhalten die Aminosäure Mutationen außerhalb des Aktiven Zentrums aufweist. Wir konnten feststellen, dass die Umschlagszahl verbessert wurde und somit die mutierten Aminosäuren von großer Bedeutung für die Katalyse sind. In beiden Kapiteln konnte festgestellt werden, dass Aminosäuren an der Kontaktoberfläche von Monomeren bezüglich der Katalyse in ECRs eine wichtige Rolle spielen.