Targeting farnesyl pyrophosphate synthase of Trypanosoma cruzi by fragment-based lead discovery

Ziel dieser Arbeit war die Entdeckung von Substanzen, die an T. cruzi FPPS (TcFPPS) binden und nicht der Stoffklasse der Bisphosphonate angehören. Zu diesem Zwecke wurde reines und homogenes TcFPPS durch rekombinante Expression in E. coli Bakterien und anschlieβende Aufreinigung mittels IMAC und SEC erhalten (Kapitel 5.1). Darüber hinaus konnte ein zuverlässiges, reproduzierbares Kristallisationssystem etabliert werden, das Kristalle mit guten Diffraktionseigenschaften liefert. Das System weist ausgezeichnete Eigenschaften für Fragment-basiertes Screening (FBS) auf, da es mit verschiedenen Kristallisationsplatten kompatibel war und Apo Kristalle lieferte, die bis zu 24 h in 15% DMSO stabil waren und die Aufnahme von Datensätzen mit einer Auflösung von etwa 1,6 Å erlaubten. Die höchste erreichte Auflösung für einen TcFPPS Kristall lag bei 1,28 Å (PDB ID 6R09). Die allosterische Tasche in TcFPPS wurde mittels Sequenzanalyse und struktureller Überlagerung verschiedener FPPS Homologe untersucht (Kapitel 5.2). Dabei zeigte sich, dass die allosterische Region in FPPS weniger konserviert ist als das aktive Zentrum. Unterschiede zwischen Aminosäuren an äquivalenten Positionen, die die allosterische Region bilden, wurden festgestellt. Dies ist überraschend, wenn man davon ausgeht, dass dieses Enzym produktinhibiert ist, wie für das humane FPPS (hFPPS) gezeigt werden konnte. Ein interessante Beobachtung war, dass die Aminosäure Phe50 in TcFPPS eine Ausnahme in einer ansonsten hochkonservierten Position ist. Es scheint die Tasche durch sterische Hinderung zu blockieren. Allosterische Inhibitoren von hFPPS wiesen zwar Bindungsaffinität zu TcFPPS auf, aber die beiden erhaltenen Kristallstrukturen zeigten, dass diese an der Proteinoberfläche binden (Bindungsstelle S1 und S2, PDB IDs 6R08 bzw. 6R07). Die Novartis Haupt- und Fluor-Fragmentbibliotheken (1336 und 482 Verbindungen) wurden auf TcFPPS getestet, was zu 63 bzw. 45 validierten Fragmentbindern führte (Kapitel 5.3). Die Durchführung des gleichen Screenings mit T. brucei FPPS (TbFPPS), dem Erreger der Afrikanischen Schlafkrankheit, und Gegenkontrolle auf hFPPS zeigte, dass einige Verbindungen selektiv an nur eines, oder zwei der Proteine binden. Auffallend war, dass TcFPPS im Allgemeinen mehr Binder hatte als TbFPPS, und auch mehr selektive Binder im Vergleich zu TbFPPS. Nachfolgende Kristallisationsexperimente mit den Bindern der Haupt-Fragmentbibliothek führten zu 3D Strukturen von zwei TcFPPS-Komplexen. Ein Ligand bindet an die Grenzfläche des Homodimers und der andere im aktiven Zentrum. Letzterer wurde mit Hilfe des Tools Pan Dataset Density Analysis (PanDDA) identifiziert. FBS mittels Röntgenkristallographie wurden im XChem Labor in Harwell, Großbritannien, und im HTX Labor in Grenoble, Frankreich, durchgeführt (Kapitel 5.4). Der XChem Screen identifizierte 35 Fragmentbinder (PDB IDs 5QPD – Z, 5QQ0 – 9, 5QQA – B) in Bindungsstellen, die über das gesamte Protein verteilt waren. Dazu gehören das aktive Zentrum, die allosterische Bindungsstelle, die Homodimer-Grenzfläche, Bindungsstellen an der Oberfläche und eine neue Tasche in unmittelbarer Nähe des aktiven Zentrums. Erstmals wurden Fragmente identifiziert, die an die allosterische Bindungsstelle von TcFPPS im offenen Zustand binden. Eine Drehung der Phenyl-Seitenkette von Phe50 führte zur Öffnung dieser vorherig geschlossenen Tasche. Der Screen im HTX Labor identifizierte acht weitere Fragmentbinder für die aktive und allosterische Tasche. Die ersten Optimisierungversuche eines Fragments zu einer Leitstruktur erfolgten mittels virtuellem Screening mit dem webbasierten Tool ANCHOR.QUERY. Sie ging von dem Fragmentbinder LUY aus (Kapitel 5.5) und mittels Eintopf-Mehrkomponentenreaktionen wurden 11 Verbindungen synthetisiert (MCR 1 – 11). Allerdings war deren schlechte Löslichkeit in nachfolgenden Tests abträglich, und Kristallisationsexperimente führten nicht zu einem Strukturmodell eines Komplexes. Danach wurde der Ansatz des Fusionierens der Fragmente AWM, LVV, LUY, LDV und AWV für die chemische Optimierung gewählt (Kapitel 5.6). Eine Bibliothek von 12 Verbindungen (MCN 1 – 12) wurde durch reduktive Aminierung synthetisiert. Kristallstrukturen mit den Verbindungen MCN-1, -4 und -8 zeigten unerwartete Bindungsmodi. Anstatt an der Bindungsstelle der Ausgangsfragmente, binden die fusionierten Substanzen an die auf der Proteinoberfläche befindliche Bindungsstelle S1 (PDB IDs 6R09, 6R0A, 6R0B). Die 50 neuen Kristallstrukturen von TcFPPS-Fragment Komplexen, die in dieser Arbeit beschrieben sind, werden neue Impulse für die Medikamentenentwicklung für CD geben. Die große Vielfalt der chemischen Strukturen der Fragmente und die unterschiedlichen Bindungsstellen sind potenzielle Ansatzpunkte für Inhibitoren mit unterschiedlichen physikalisch chemischen Eigenschaften und einer neuartigen Wirkungsweise, die helfen könnten, die mit den Bisphosphonaten verknüpften Einschränkungen zu überwinden.