Targeting Trypanosoma brucei FPPS by Fragment-based drug discovery

Trypanosoma brucei (T. brucei) ist der Erreger der Afrikanischen Trypanosomiasis, einer vernachlässigten Krankheit mit einem endemischen Auftreten in 36 Subsahara-Ländern. Da derzeitige Behandlungmöglichkeiten eine geringe Wirksamkeit und starke Nebenwirkungen aufweisen, sind neue verbesserte Medikamente dringend erforderlich. Stickstoffhaltige Bisphosphonate, die derzeit bei Knochenerkrankungen eingesetzt werden, blockieren das Wachstum der T. brucei Parasiten durch Hemmung der Farnesylpyrophosphat-Synthase (FPPS), sind aber aufgrund ihrer speziellen pharmakokinetischen Eigenschaften nicht für die parasitäre Therapie geeignet. Vor kurzem wurde im humanen FPPS eine zusätzliche allosterische Tasche entdeckt, die basierend auf einer Sequenzanalyse wahrscheinlich auch in T. brucei FPPS vorhanden ist. Die hohe medizinische Notwendigkeit in Kombination mit der Entdeckung einer potenziellen neuen Bindungstasche führte zu einem fragmentbasierten Ansatz zur Entwicklung von neuen nicht-Bisphosphonat-basierten Verbindungen für T. brucei FPPS, welcher in dieser Arbeit vorgestellt wird. Kristallographisches und NMR-basiertes Fragmentscreening wurde durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde ein robustes T. brucei FPPS Kristallisationssystem etabliert, das die High throughput Bestimmung von Kristallstrukturen mit einer Auflösung von bis zu 1,67 Å ermöglicht. Strukturelle Überlagerungen zeigten, dass die auf dem humanen FPPS gefundene allosterische Tasche, tatsächlich in T. brucei FPPS existiert. Diese Entdeckung ermöglichte anschließende NMR- und Kristallisationsxperimente mit etablierten humanen FPPS-Verbindungen, die zu drei Protein-Liganden-Komplexstrukturen mit gebundenen Fragmenten in der bisher unbekannten allosterischen Tasche führten. Für die meisten der getesteten Verbindungen lag der durch SPR (Surface plasmon resonance) bestimmte Kd-Wert für T. brucei auβerhalb des experimentellen Testbereichs. Nur für eine Verbindung wurde der Kd-Wert auf T. brucei FPPS bestimmt und war um drei Größenordnungen höher als der IC50 Wert auf dem humanen FPPS. Die Kristallstrukturanalyse ergab unterschiedliche Bindungsmodi auf den beiden FPPS Enzymen und zeigte reduzierte Protein-Ligand-Interaktionen auf T. brucei FPPS, wodurch die deutlich unterschiedliche Bindungsaffinität erklärt werden kann. Ermutigt durch die Entdeckung erster Verbindungen die in der allosterischen Tasche auf T. brucei FPPS binden, wurden Fragment-Pools durch Ligand-NMR im Screen getestet und identifizierte Hits durch Experimente mit einzelnen Verbindungen in Liganden-NMR und Protein NMR weiterverfolgt. Dadurch wurden 25 validierte Fragmente auf T. brucei FPPS entdeckt, die durch Soaking- und Ko-kristallisationsexperimente weiterverfolgt wurden. Kristalldaten wurden mit PanDDA (Pan-Dataset Density Analysis) analysiert und sieben Protein Liganden-Komplexstrukturen wurden gelöst. Von den sieben Fragmenten waren vier Fragmente in der katalytischen Tasche gebunden, ein Fragment wurde in der allosterischen Tasche entdeckt, die als Teil dieser Arbeit identifiziert wurde, und zwei Fragmente waren an Bindungsstellen an der Oberfläche gebunden. Insbesondere ein Fragment mit einem vieratomigen flexiblen Linker, das in der katalytischen Tasche gebunden war, war orthogonal zu den anderen drei Liganden und entlang der Helix αD gebunden. Sechzehn Fragmentanaloge des länglichen flexiblen Fragmentes in der katalytischen Tasche wurden zur Optimierung der Struktur-Aktivitätsbeziehung getestet und eine Kristallstruktur mit einem Fragmentanalogen in der allosterischen Tasche wurde gelöst. Zusätzlich wurden Fragment-Screens durch Kristallisation bei XChem (Diamond, UK) und am EMBL/ESRF (Grenoble, FR) durchgeführt, die zu sieben Protein-Ligand-Strukturen führten. Ein Fragment war in der katalytischen Tasche gebunden, drei Fragmente in der allosterischen Tasche, zwei Fragmente in einer kryptischen Tasche zwischen den Helices αI und αH und ein Fragment auf der gegenüberliegenden Seite der allosterischen Tasche nahe den Helices αG und αF. Die Fragmentbindung wurde zusätzlich in Protein-NMR validiert. Da Fragmente typischerweise eine geringe Bindungsaffinität bis in den mM-Bereich aufweisen, wurde eine strukturbasierte Fragment-Optimierung durch Medizinalchemie durchgeführt. Insgesamt wurden zehn Verbindungen synthetisiert und in Protein-NMR und in Kristallisationsexperimente getestet. Auffallend war ein fusioniertes Fragment basierend auf T. brucei und T. cruzi FPPS Verbindungen. Dieses Fragment ist in einer neuen Bindungsstelle nahe dem zweiten DDxxD Motiv gebunden. Zusammenfassend stellt diese Arbeit hochauflösende Kristallstrukturen von T. brucei FPPS vor und zusätzlich wurden 19 Verbindungen entdeckt, die an sieben verschiedene Bindungsstellen der T. brucei FPPS binden. Dadurch wurde der Weg für zukünftige Studien zur Entdeckung von hochaffinen Nicht-Bisphosphonat-Inhibitoren mit pharmakokinetischen Eigenschaften für parasitäre Indikationen auf T. brucei FPPS geebnet.