Studies of Single-Molecule Dynamics in Microorganisms

Fluoreszenzmikroskopie ist eine der am häufigsten genutzten Techniken in den Lebenswissenschaften. Betrachtetmandienichtinvasive Probenvorbereitung,welche Lebendzell-verträgliche Bildgebung ermöglicht, und die spezifische Fluoreszenzmarkierung, welche die spezifische Visualisierung von nahezu jedem Zellbestandteil zulässt, ist sogar die Lokalisierung eines einzelnen Moleküls in lebenden Zellen möglich. Dies macht moderene Fluoreszenzmikroskopie zu einem leistungsstarken Werkzeugkasten. In den vergangen Jahrzehnten hat die Entwicklung neuer, hochauflösender Fluoreszenzmikroskopietechniken das Forschungsfeld revolutioniert. SMLM ist eine Klasse dieser hochauflösenden Mikroskopiemethoden und ermöglicht die Auflösung bis auf zehn Nanometer. SMLM Methoden wie PALM, (d)STORM, GSDIM und PAINT haben es erlaubt sowohl die intrazelluläre, räumliche Organisation von Proteinen als auch ihre Echtzeitdynamiken auf der Einzelmolekülebene in lebenden Zellen zu untersuchen. Der Fokus dieser Doktorarbeit war die Entwicklung neuer Werkzeuge und Strategien für die Lebendzell-sptPALM Bildgebung und deren Anwendung für die biologische Forschung. Im ersten Teil meiner Arbeit beschreibe ich die Entwicklung von neuen pcFPs, welche für sptPALM optimiert sind und den durch die Bildgebung verursachten phototoxischen Schaden verringern. Des Weiteren zeigen wir die Verwendung zusammen mit paFPs, was uns die Markierung mehrerer Ziele und das Auslesen in einem einfarbigen Kanal ermöglicht und sowohl die Probenvorbereitung, die Routine der Bildaufnahme als auch die Datenauswertung der Vielfarbenbildgebung lebender Zellen erheblich vereinfacht. Parallel zur Entwicklung neuer fluoreszierender Proteine habe ich eine Hochdurchsatz Datenauswertungs-Pipeline entwickelt. Angewendet habe ich diese Pipeline in meinem zweiten Projekt, das im zweiten Teil meiner Arbeit beschrieben ist, in welchen ich die Proteinorganisation und -dynamik des CRISPR-Cas antiviralen Abwehrmechanismus von Bakterien in vivo auf hoher räumlich-zeitlicher Ebene mit dem sptPALM Ansatz untersucht habe. Ich konnte erfolgreich den Unterschied in den Zielsuchdynamiken der CRISPR Effektor-Komplexe sowie einzelner Cas Proteine für unterschiedliche Zielsequenz-Komplementaritäten zeigen. Außerdem präsentiere ich erste Daten,die langanhaltende Bindungszeiten zwischen Effektor-Komplex und ihren potentiellen Zielen in vivo beschreiben, für die bislang nur in vitro Daten verfügbar waren. Zusammenfassend ist diese Doktorarbeit ein signifikanter Beitrag sowohl für den Fortschritt der derzeitigen sptPALM Bildgebungsmethoden, als auch für das bessere Verständnis des natürlichen Verhaltens des CRISPR-Cas Systems in vivo.