Establishment of new experimental models of progressive prodromal Parkinson’s disease using viral-mediated overexpression of wild-type human α-synuclein in the substantia nigra compacta and the locus coeruleus in mice

Part 1. Summary Alpha-7-nikotinische Acetylcholin-Rezeptor (α7-nAChR) -Agonisten modulieren den cholinergen anti-inflammatorischen Signalweg, indem sie proinflammatorische Signale abschwächen und den Verlust von dopaminergen Nervenzellen in Toxin-induzierten Mausmodellen der Parkinson-Krankheit (PD) reduzieren. Allerdings fehlen Studien, die die Wirkung von α7-nAChR-Agonisten in PD-Modellen mit humanem Alpha-Synuklein (hαSyn) testen. Wir untersuchten daher die Wirkung des spezifischen α7-nAChR-Agonisten JN403 in-vitro in hαSyn-behandelten Mikroglia-Zellkulturen sowie in-vivo in Mausmodellen mit hαSyn-Überexpression. In den unbehandelten murinen Mikrogliazellen erhöhte die Behandlung mit dem hαSyn-Fragment 61-140 die Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO), TNF-α und IL-6 und verringerte die Viabilität der Zellen. Die Vor- und Ko-Inkubation mit 100 nM JN403 dazu reduzierte die Menge an NO- und TNF-α-Freisetzung in den Mikrogliazellen signifikant. Die Viabilität der Zellen und die IL-6-Freisetzung kehrte jedoch nicht auf das Kontrollniveau zurück. Für das in-vivo Experiment mit JN403 wurde in C57/BL6N-Mäusen eine unilaterale intranigrale Überexpression von WT-αSyn bzw. des Kontrollproteins Luciferase (luc) durch stereotaktische Verabreichung eines rekombinanten adeno-assoziierten Virus (rAAV)-Vektors induziert. Die gezielte WT-αSyn-Überexpression reduzierte nach 10 Wochen 20% der Tyrosinhydroxylase (TH)-immunoreaktiven (ir) nigralen Neurone. Eine tägliche subkutane Behandlung mit 30 mg/kg JN403 über 9 Wochen ab der ersten postoperativen Woche konnte den Verlust der TH-ir nigralen Neurone nicht aufhalten (noch die der Iba1-ir-Dichte). Die reduzierte Dichte von TH-ir striatalen Endigungen in WTαSyn-Gruppen war auch nach JN403-Behandlung unverändert. Zusammenfassend reduzierte der spezifische α7-nAChR-Agonist JN403 proinflammatorische Zytokine in αSyn-exponierten Mikrogliazellen in-vitro, jedoch konnten wir unter der Behandlung mit JN403 keinen signifikanten Effekt im in-vivo Mausmodell mit intranigraler Überexpression von WT-αSyn finden. Part 2. Summary Der Locus Coeruleus (LC) ist ein kleiner Nukleus unter den katecholaminergen Zellgruppen, aber er hat stark verzweigte Axone und innerviert dadurch große Bereiche im Gehirn. Nach dem akzeptierten Staging-Modell der Parkinson-Krankheit (PD) von Braak ist der LC ab der zweiten Staging-Phase von Alpha-Synuklein (αSyn)-Pathologie betroffen. Die möglichen neurochemischen Veränderungen durch axonale αSyn-Übertragung aus dem LC wurden allerdings bislang nie untersucht. Daher überexprimierten wir humanes Wildtyp αSyn (WT-αSyn) bzw. das Kontrollprotein Luciferase (Luc) im LC durch einseitige stereotaktische Gabe von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) Vektoren und untersuchten anschließend pathologische Veränderungen in Abhängigkeit der Zeit. Eine unvoreingenommene Stereologie zeigte, dass die Anzahl der LC-Neuronen nach WT-αSyn-Überexpression nicht signifikant abnahm, jedoch traten 3 Wochen nach der Injektion ausgeprägte Mikrogliose und Astrogliose auf. Interessanterweise nahm die Anzahl der Cholinacetyltransferase (ChAT)-immunoreaktiven (ir) Neurone im dorsalen motorischen Nucleus des Nervus vagus (DMnX) und im Nucleus ambiguus (nAmb) in der αSyn-Gruppe bereits nach 3 Wochen signifikant ab. Die mutmaßliche axonale Konnektivität zwischen dem LC und den cholinergen motorischen Kernen sowie der Verlust von ChAT-ir wurden durch Mikroinjektion von Tyrosin-Hydroxylase (TH) -Promotor-spezifischen viralen Vektoren (rAAV2/5-TH-EGFP/WT-αSyn) in den LC weiter aufgeklärt. Wir fanden robuste αSyn-ir-axonale Varikositäten um die DMnX-Neurone und erstaunlicherweise auch intraneurales αSyn in Neuronen des nAmb in beiden Hemisphären 3 Wochen nach der Injektion. Da die pars compacta des nAmb die Speiseröhre innerviert, suchten wir nach αSyn in den zervikalen, thorakalen und abdominalen Teilen des Ösophagusgewebes der WT-αSyn-injizierten Mäuse und der Kontroll-Mäuse. Als Ergebnis der aSyn-Überexpression im LC beobachteten wir αSyn-ir-Zellen und Varikositäten in den Muskelschichten. Bemerkenswerterweise waren einige dieser αSyn-ir-Neuronen nach 3 und 9 Wochen mit Plexusganglien des Plexus myentericus kolokalisiert. Darüber hinaus fanden wir, dass im Gegensatz zu den meisten Signalen des vesikulären Acetylcholin-Transporter (VAChT) einige Nervenendigungen schwach und von den motorischen Rezeptoren entfernt waren waren. Unsere Daten zeigen, dass es zu transsynaptischem und transneuronalem „Spreading“ von αSyn vom LC in die vagalen motorischen Kernen kommt, was zur Suppression von cholinergen Efferenzen an den motorischen Endplatten in der Speiseröhre führt. Es scheint, dass αSyn über anatomisch verbundene Hirnregionen wandern kann, wie bereits im Braak Staging-Modell von PD postuliert, und dass eine α-Synuklein-Pathologie in noradrenergen Neuronen möglicherweise die cholinerge Modulation des rostral-kaudalden oberen Gastrointestinaltrakts stört.