Localization and biochemical characterization of the small secreted protein Dld1 from the root endophytic fungus Piriformospora indica

Piriformospora indica ist ein Symbiont mit einer biphasischen Kolonisierungsstrategie. Er kolonisiert ein breites Spektrum von Wirtspflanzen, inklusive der monokotyledonen Pflanze Hordeum vulgare (Gerste), in der er eine Vielzahl von nützlichen Effekten bewirkt. Die Interaktion weißt Charakteristika der pflanzlichen Immunantwort auf, einschließlich der lokalisierten Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species; ROS) und der Bildung von Zellwandappositionen (engl. cell wall apposition(s); CWA). Ferner wird die Kolonisierung von Gerste durch die Anreicherung von reaktivem Fe3+ in CWAs begleitet, die wiederum die Produktion von ROS vermitteln. In der pflanzlichen Immunantwort sind ROS unter anderem für die Festigung und den Ausbau von CWAs durch die Polymerisierung von Ferulasäure und die chemische Quervernetzung von Abwehrproteinen und phenolischen Verbindungen mit Zellwandpolymeren verantwortlich. In den frühen Stadien der P. indica / Gerste Interaktion, wenn der Pilz versucht die pflanzliche Zellwand zu durchstoßen, was zu Bildung von CWAs führt, wird die Expression des P. indica Gens PIIN_05872 (nachfolgend als DLD1 bezeichnet) hochreguliert. Das kodierte Protein Dld1 gehört zu einer P. indica-spezifischen Proteinfamilie, welche sich durch eine Vielzahl von regelmäßig verteilten Histidinen und Alaninen, sowie einem C-terminal lokalisieren Motiv mit der Konsensussequenz RSIDELD auszeichnet. In dieser Arbeit wurden die Lokalisierung, sowie die biophysikalischen und biochemischen Charakteristika von Dld1 untersucht. Obwohl die Sekretion von Dld1 durch P. indica unklar bleibt, konnte gezeigt werden, dass Dld1 sowohl von Ustilago maydis Dld1-Expressionsstämmen in vitro und in planta, als auch während transienter Expression in Gerstenzellen, sekretiert wird. In Gerste zeigt Dld1 eine Kolokalisation mit Fe3+ in CWAs, die als Antwort auf eine Pilzinfektion gebildet werden. Dld1 wurde heterolog in Escherichia coli produziert. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Lupas aus Tübingen wurde das gereinigte Protein für CD-Spektroskopie und Protein-Röntgen-Kristallstrukturanalyse verwendet. Die Kristallstruktur zeigt, dass Dld1 eine Coiled-coil Struktur aus zwei antiparallelen Alpha-Helices einnimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die Struktur pH-sensitiv ist. Während die Histidine auf einer Seite der Helix hervorstehen und wie die Zähne eines Reißverschlusses ineinandergreifen, nehmen die Alanine die meisten Positionen auf der Helix-Innenseite ein, um eine räumlich enge Struktur zu ermöglichen, die in der Vergangenheit als Alacoil benannt wurde. Mit qualitativen und quantitativen Metallbindeassays konnte gezeigt werden, dass Dld1 verschiedene Metallionen binden kann. Die Dissoziationskonstanten für eine Bindung von Fe3+ und Zn2+ konnten im niedrigen mikromolaren Bereich bestimmt werden. Ursprünglich wurde für Dld1 eine Funktion als Metall-Scavenger vermutet, aber Dld1 kann eine Fe3+-katalysierte Oxidation des chemischen Substrats Diaminobenzidin nicht verhindern. Stattdessen, inhibiert Dld1 die Radikal-induzierte Polymerisation von Diaminobenzidin. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass Dld1 analoge Reaktionen an der pflanzlichen Zellwand verhindern könnte, z.B. die Polymerisierung von Ferulasäure. Dies könnte schlussendlich dazu beitragen, dass P. indica fähig ist die von Gerste gebildeten CWAs zu überwinden, um eine kompatible Interaktion zu etablieren.