Directed Evolution of an Fe(II)-Dependent Halogenase for Asymmetric C(sp3)-H Chlorination

Within this thesis, the chlorinase Wi-WelO15 from Westiella intricata UH strain HT-29-1 was explored for its evolvability towards non-natural substrates and its biocatalytic applicability. Organohalogens play an important role as pharmaceuticals and agricultural chemicals or synthetic intermediat...

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Main Author: Düwel, Sabine
Contributors: Höbenreich, Sabrina (Dr. rer. nat.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2018
Subjects:
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Table of Contents: Im Rahmen dieser Arbeit wurde Chlorinase Wi-WelO15 von Westiella intricata UH HT-29-1 bezüglich ihrer Anpassungsfähigkeit an nicht-natürliche Substrate sowie ihre biokatalytische Anwendung getestet. Organohalogene spielen eine wichtige Rolle als Pharmazeutika, Agrarchemikalien oder synthetische Intermediate. Jedoch ist die selektive Chlorierung aliphatischer Kohlenstoffe an komplexen Molekülen unter milden, nicht giftigen Bedingungen noch immer eine große Herausforderung in der chemischen und enzymatischen Katalyse. 2014 wurde eine neue Klasse aliphatischer Halogenasen entdeckt, die ein großes Potential als Biokatalysator für late-stage Chlorierung hat. Die Enzymklasse gehört zu einer großen Familie von nicht-Häm-Eisen Oxygenasen. Eine zuvor gefundene Unterklasse von aliphatischen Halogenasen ist abhängig davon, dass die Substrate an ein Acyl-Carrier-Protein gebunden sind. Im Gegensatz dazu, können Mitglieder der neuen Halogenasen-Unterklasse freistehende Substrate halogenieren. Synthetische Methoden, die von Chemikern benutzt werden um gewünschte Substrate herzustellen, können als Synthese-Werkzeugkoffer verstanden werden. Wenn diese Klasse von Halogenasen so angepasst werden kann, dass nicht-natürliche Substrate selektiv chloriert werden und die Enzyme im Labor einfach produziert und verwendet werden können, können sie als neue Methode zum Werkzeugkoffer hinzugefügt werden um Halogene zu einem späten Synthesestadium an komplexe Moleküle hinzuzufügen.. Wi-welO15 and Hw-welO15 (von Hapalosiphon welwitschii UH IC-52-3) wurden aus der entsprechenden genomischen DNA amplifiziert und in ein Plasmid, welches mit hoher Kopienanzahl in der Zelle vorliegt, eingefügt. Durch heterologe Expression in E. coli konnten die Halogenasen in guten Ausbeuten von 60-80 mg/L Zellkultur hergestellt werden. Aufreinigung wurde durch Affinitäts-Chromatographie und wenn nötig auch Größenausschlusschromatographie erreicht. Kristallisation der Variante Wi-0, der Startpunkt für die gerichtete Evolution, wurde erreicht und die Enzymstruktur konnte gelöst werden. Um die Chlorierungsaktivität an nichtnatürlichen Substraten zu untersuchen, wurde eine Anzahl nicht natürlicher Substrate synthetisiert, die eine Keto-Funktion, anstelle des natürlich vorkommenden Isonitriles, tragen. Diese wurden durch die Wildtyp Enzyme unter initialen Bedingungen nicht chloriert. Zunächst, als keine Strukturinformationen vorhanden waren, wurde ein Enzym-Model mit Hilfe von SwissModel kreiert um Hw-WelO15 zufällig zu mutieren. Als die Enzymstruktur von Wi-0 gelöst war, wurde gerichtete Evolution mittels semi-rationaler und rationaler Mutagenese angewendet. Innerhalb von 4 Generationen wurde die Halogenase an das ausgewählte Leitmolekül angepasst. Eine Anzahl an Chlorinasen wurden als Zelllysate sowie als aufgereinigt Enzyme getestet und die besten Varianten zeigten 87% Produktbildung unter optimierten Bedingungen, während die Startvariante Wi-0 Produktbildung von <1% zeigt. Modifikationen am Leitmolekül wurden teilweise akzeptiert und insgesamt wurde die regio- und diastereoselektive Chlorierung von fünf nicht-natürlichen Substraten, mit Chemoselektivitäten von 96- 99% ermöglicht. Weitere fünf Substrate wurden in komplexe Produktmixe transformiert. Unter allen gebildeten Produkten konnte nur ein chloriertes Produkt gefunden werden. Wenn nicht-natürliche Substrate von Halogenasen umgesetzt werden, werden häufig vor allem hydroxylierte Produkte gebildet. Eine Enzymvariante, die während der gerichteten Evolution gefunden wurde, hatte eine verringerte Chemoselektivität von 68% Chlorierung und 32% Hydroxylierung. Mit dem Ziel Biokatalysatoren zu erschaffen, die nur Hydroxylierung erzielen, wurden mehrere Varianten erstellt, diese hatten jedoch keine Aktivität. Stattdessen wurde die Monooxygenase P450BM3 verwendet um vier neue, hydroxylierte und epoxidierte Produkte herzustellen. Halogenasen, die während verschiedenen Stufen der gerichteten Evolution gefunden wurden, wurden bezüglich ihrer kinetischen Eigenschaften untersucht. Dabei zeigte sich, dass die beste Variante eine 93-fache Verbesserung im Vergleich zum niedrigsten, messbaren kcat/Km hatte. Die beiden Varianten mit höchster Produktbildung unterschieden sich jeweils in ihren Eigenschaften. Während Wi-11 mit einem kcat von 0.64 min-1die höchste Umsatzrate hat, kann Wi-12 die Substrate besser binden mit dem niedrigsten Km von 20 μM. Weiterhin wurde die Stabilität der Halogenasen untersucht und stabilisierte Wi-WelO15 Varianten, die von dem PROSS Server vorgeschlagen wurden, hergestellt. Zum Auslesen der Stabilität wurde die Schmelztemperatur (Tm) der Enzyme bestimmt. Es zeigte sich, dass die Halogenasen mit Tm von 62 °C für Hw-WelO15 und 54 °C für Wi-WelO15 schon recht stabil sind. Die hergestellten Varianten während des Aktivitätsscreening zeigten im Vergleich zur Startvariante generell schon eine leichte Verbesserung in ihrer thermischen Stabilität und Kombination aus stabilitäts- sowie aktivitätsverbessernden Mutationen resultierte in der stabilsten Wi-WelO15 Variante Wi-5P3 mit Tm=61 °C. Inkubation der aufgereinigten Enzyme in Puffer bei verschiedenen Temperaturen mit anschließender SDS-PAGE Analyse zeigte, dass für die stabilste Variante nach 4 h bei 65 °C immer noch lösliches Enzym vorhanden war. Aktivitätstests bei erhöhten Temperaturen zeigten überdies eine Restaktivität von 90% bei Reaktionen, die bei 45 °gemacht wurden sowie 85% Restaktivität in Anwesenheit von 5% Ethanol.