Integration of biomolecular logic principles with electronic transducers on a chip

Boolean operations applied in biology and integrated with electronic transducers allow the development of a new class of digital biosensors for the detection of multiple input signals simultaneously and in real-time. With the help of Boolean functions (AND, OR, etc.), an electrical output signal wil...

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Main Author: Molinnus, Denise
Contributors: Schöning, Michael J. (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2018
Subjects:
Ing
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Table of Contents: In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Konzepte mit biologischen Schaltungen, die auf elektronischen Transducern integriert sind, entwickelt. Damit können neuartige digitale Biosensoren aufgebaut werden, die in Abhängigkeit der Eingangssignale ein elektrisches Ausgangssignal generieren. Als erstes Konzept wird ein "BioLogicChip" vorgestellt, der die "Sense-act-treat"-Funktion auf einem Chip kombiniert. Mit diesem BioLogicChip soll es möglich sein, eine bestimmte Krankheit abhängig von spezifischen Biomarkern zu diagnostizieren. Gleichzeitig soll mit diesem Chip eine bestimme Menge des benötigten Wirkstoffs dem Patienten verabreicht werden können. In dieser Arbeit wurde das Konzept exemplarisch als "künstliche Pankreas" dargestellt. Der Chip-basierte Glukosesensor wurde als logische AND-Schaltung konzipiert, mit Glukose und Sauerstoff als Eingangssignale. Nur wenn beide Eingangssignale gleichzeitig vorhanden sind, kommt es zur Reaktion und ein Strom wird generiert. Dieser Strom kann dann zur Adressierung des impedimetrischen Sensors genutzt werden, auf dem ein temperaturabhängiges Hydrogel immobilisiert ist. Dieses Hydrogel dient, auf Grund seiner Quell- und Schrumpf-Eigenschaft, als Aktuator und kann somit zwischen "AUF" und "ZU" schalten. Damit kann eine bestimmte Menge eines Medikamentes (z.B. Insulin) freigesetzt werden. Um das Hydrogel auf seine Aktuatorfunktion zu prüfen, wurde die Impedanz bei verschiedenen Temperaturen (28 °C – 42 °C) untersucht. Im Gegensatz zur konventionellen "künstlichen Pankreas", wird bei dem BioLogicChip die Freisetzung des Wirkstoffs durch den Aktuator zusätzlich sensorisch überprüft. Hierbei dient ein Chip-basierter IrxOy-Sensor zur Insulinmessung. Als zweites Konzept wurde ein digitaler Adrenalinbiosensor entwickelt, mit dem Adrenalinkonzentrationsunterschiede zwischen Nebennierenblut und peripherem Blut gemessen werden sollen, um so die Position des Katheters während der Nebennierenvenen-katheteruntersuchung (AVS) zu überprüfen. Zur Entwicklung des Adrenalinbiosensors wurde ein Sauerstoffsensor mit einer 2-Enzymmembran, bestehend aus Laccase und Pyrroloquinolinchinon-abhängiger Glukose-Dehydrogenase (PQQ-GDH) modifiziert. Damit findet das Substraterecycling-Prinzip Anwendung, wodurch das Sensorsignal verstärkt wird. Im ersten Reaktionsschritt wird Adrenalin mit Hilfe der Laccase unter Sauerstoffverbrauch zu Adrenochrom oxidiert. Anschließend wird das entstandene Adrenochrom wieder über die PQQ-GDH zurück zu Adrenalin reduziert, bei gleichzeitiger Oxidation von Glukose. Der verbrauchte Sauerstoff wird mittels O2-Sensor gemessen und ist proportional zur Adrenalinkonzentration. Mit dem Adrenalinsensor konnte in Puffer- und Ringerlösung eine untere Nachweisgrenze von 1 nM bei pH 7,4 und 30 °C erreicht werden. Außerdem wurde die Querempfindlichkeit gegenüber anderen Katecholaminen (Noradrenalin, Dopamin, Dobutamin) überprüft. Zusätzlich konnten gespikte Adrenalinproben (1 nM – 150 nM) im Blutplasma untersucht werden. Außerdem wurden mit dem digitalen Adrenalinsensor "Proof-of-principle"-Experimente aus zwei aufeinanderfolgenden logischen AND-Schaltungen durchgeführt (Laccase als erste logische AND-Schaltung; PQQ-GDH als zweite logische AND-Schaltung). Mit diesem digitalen Adrenalinbiosensor kann eine schnelle, qualitative Analyse über die Adrenalinkonzentration im Blut erfolgen; der Arzt kann die Position des Katheters überprüfen und gegebenenfalls korrigieren. Im weiteren Verlauf wurde der Adrenalinbiosensor hinsichtlich seiner Miniaturisierbarkeit weiterentwickelt. Dazu wurde ein Chip-basierter Platinsensor mit dem Enzym PQQ-GDH modifiziert, um das bioelektrokatalytische Messprinzip zu ermöglichen, um so Adrenalin zu recyclen und das Sensorsignal zu verstärken. Der Chip-basierte Adrenalinbiosensor wurde bezüglich pH-, Temperatur- und Glukose-Optimum charakterisiert. Dabei konnte eine untere Nachweisgrenze von 1 nM bei einem physiologischen pH-Wert von pH 7,4, bei 30 °C und bei einer Glukosekonzentration von 20 mM erreicht werden. Darüber hinaus wurde die Langzeitstabilität des Biosensors über zehn Tage untersucht. Zusätzlich wurde die Sensitivität des Chip-basierten Biosensors gegenüber verschiedener Katecholaminen (Noradrenalin, Dopamin und Dobutamine) validiert. Die höchste Empfindlichkeit wurde bei Messungen mit Adrenalin erreicht. Es konnten erfolgreich erste Messungen in Blutplasma durchgeführt werden. Mit dem entwickelten Adrenalinbiosensor konnte außerdem die Konzentrationsdifferenz zwischen Nebennierenblut und peripherem Blut gemessen werden. Neben logischen Schaltungen mit amperometrischen Sensoren, wurden auch logische Schaltungen mit Feldeffekt-Sensoren am Beispiel eines Acetoinbiosensors entwickelt. Dieser soll für die Bestimmung verschiedener Acetoinkonzentrationen (z.B. in der Fermentation von Bier und Wein) eingesetzt werden. Der Feldeffekt-Sensor wurde mit Hilfe des Enzyms Acetoinreduktase modifiziert, wodurch rakemisches Acetoin zu (R,R)-2,3-Butandiol und Meso-Butandiol katalytisch umgesetzt wird. Bei dieser Reaktion werden H+-Ionen verbraucht. Der entwickelte Sensor zeigt ein lineares Verhalten bei Acetoinkonzentrationen zwischen 3 mM und 90 mM. Die höchste Sensitivität des Acetoinbiosensors konnte bei pH 7,1 erreicht werden. Es wurde die Langzeitstabilität über fünf Tage überprüft. Darüber hinaus wurden gespikte Acetoinkonzentrationen in Weißwein gemessen. Zukünftig könnte der Sensor als digitaler Acetoin/Diacecyl-Biosensor weiterentwickelt werden, da beide Substanzen zum Geschmack von Bier/Wein beitragen. Boole`sche JA/NEIN-Aussagen würden so den Status der Fermentation abbilden.