RNA species in the host-pathogen dynamics during Legionella infection of human macrophages

Legionella pneumophila (L.p.) ist ein gram-negatives, intrazelluläres Pathogen und eine häufige Ursache von schweren ambulant-erworbenen Pneumonien. L.p. repliziert im Menschen hauptsächlich in Alveolarmakrophagen. Durch die Sekretion von über 300 Effektorproteinen in das Zytosol der Wirtszelle manipuliert das Bakterium wichtige Wirtszellfunktionen wie den Vesikeltransport und die Genexpression. Somit ändert L.p. wichtige Funktionen der Wirtszelle, um seine eigene Replikation zu fördern. Eine globale Analyse der molekularen Veränderungen und biologischen Prozesse, die mit bakteriellen Infektionen von humanen Zellen verbunden sind, kann neue Einblicke in die Wirts-Pathogen-Interaktionen ermöglichen. Daher war ein Ziel dieser Studie, die Expressionsveränderungen verschiedener RNA-Spezies nach Infektion mit L.p. in primären Blutmakrophagen (BDMs) oder differenzierten THP-1-Zellen zu untersuchen. Diese Arbeit ist in zwei Teile gegliedert: (1) Eine funktionelle Studie, wie eine miRNAManipulation die Replikation von L.p. in Makrophagen beeinflussen kann, und (2) eine globale Analyse von Transkriptom-Veränderungen in Wirt und Pathogen während der Infektion. (1) In den letzten Jahrzehnten haben sich miRNAs als wichtige Modulatoren der Immunfunktion etabliert. Daher sollte das miRNA-Profil von L.p.-infizierten Makrophagen identifiziert und der funktionelle Einfluss einer miRNA-Manipulation auf die L.p.-Replikation untersucht werden. Dafür wurden BDMs von gesunden Spendern mit L.p. des Stammes Corby infiziert. Die Sequenzierung der kleinen RNAs führte zur Identifizierung des miRNA-Profils von L.p.-infizierten BDMs. Es wurde eine Hochregulation von miR-146a und miR-155, sowie eine Herunterregulation von miR-221 und miR-125b in Makrophagen mittels qPCR validiert. Die miRNA-Regulation nach einer L.p.-Infektion scheint auf die transkriptionelle Veränderung von miRNA-Promotoren zurückzuführen zu sein, da die Acetylierungslevel und die pri-miRExpression mit der miRNA-Expression nach einer L.p-Infektion korrelierten. Zur funktionellen Charakterisierung wurden Überexpressions- und Knockdown-Experimente der miRNAs miR-125b, miR-221 und miR-579 durchgeführt. Diese zeigten einen Einfluss auf die bakterielle Replikation. Mit der Hilfe eines SILAC-Ansatzes wurde MX1 als herunterreguliertes Protein nach gleichzeitiger Überexpression aller drei miRNAs identifiziert. MX1 ist ein Interferoninduziertes GTP-bindendes Protein, das für die antivirale Abwehr wichtig ist. Wie durch Validierungsexperimente gezeigt wurde, führte der Knockdown von MX1 zu einer erhöhten Replikation von L.p., die auch nach Überexpression der miRNAs beobachtet wurde. Da in silico- Analysen keine Bindungsstellen für die miRNAs in der 3'UTR von MX1 vorhersagten, wurde eine Ingenuity-Pathway-Analyse durchgeführt, um konnektive Moleküle zu identifizieren. DDX58 (RIG I), ein Sensor für zytosolische RNA, wurde als Zielmolekül der miR-221 validiert, während der Tumorsuppressor TP53 mittels Luciferase-Reporter-Assay als Zielmolekül der miR-125b bestätigt wurde. Eine siRNA-vermittelte Herunterregulation von TP53 als auch DDX58 führte zu einer verstärkten Replikation von L.p. in Makrophagen. Daher wurden DDX58 und TP53 als verbindende Moleküle zwischen den drei miRNAs und MX1 validiert. Zusätzlich zeigte der oben erwähnte SILAC-Ansatz eine Herunterregulierung von LGALS8, welches anschließend als Zielmolekül der miR-579 identifiziert wurde. LGALS8 ist ein zytosolisches Lektin, das Kohlenhydrate bindet. Der Knockdown von LGALS8 erhöhte die intrazelluläre Replikation in Makrophagen. Zusammenfassend wurden MX1 und LGALS8 als Zielmoleküle der drei miRNAs (miR-125b, miR-221, miR-579) identifiziert, die zur Verminderung der L.p.- Replikation in humanen Makrophagen beitragen. (2) Das Transkriptionsprofil von L.p.-Infektion in humanen Makrophagen wurde mittels dual RNA-Seq untersucht, um die Regulation von kodierenden und nicht-kodierenden RNAs während einer Infektion von Wirt und Pathogen gleichzeitig zu bestimmen. Nach Anpassung und Optimierung bestehender Protokolle wurden die Makrophagen mit einem GFP-exprimierenden L.p.-Stamm infiziert. Um infizierte Zellen (gfp+) von den nicht infizierten Zellen (gfp-) zu trennen, wurden durchflusszytometrische Sortierungen durchgeführt. Eine differentielle Genexpressionsanalyse wurde unter Verwendung von DESeq2 durchgeführt, wodurch 4.144 differentiell exprimierte humane Gene und 2.707 differentiell exprimierte bakterielle Gene identifiziert wurden. Die DESeq-Analyse der Wirtszellen zeigte differentiell exprimierte mRNAs (3.504), lncRNAs (495) und miRNAs (145). Davon waren 1.128 differentiell exprimierte Gene ausschließlich in den infizierten Zellen (gfp+ nach 8 und 16 h) signifikant reguliert. Einigen von diesen Genen wurden erfolgreich mittels qPCR validiert (BCL10, SOD1, IRS1, CYR61, ATG5, RND3 und JUN). Außerdem wurde die Regulation der Gene ZFAND2A und HSPA1 validiert, die in gfp- als auch in gfp+ Zellen eine Hochregulation aufwiesen. Die Analyse der bakteriellen mRNAs zeigte eine inverse Regulation zwischen 8 und 16 h. Dazu gehörten Gene, die am Eisenstoffwechsel, der Stressantwort, der Glykolyse und der Lipidbiosynthese beteiligt sind. Zusammenfassend wurden also differentiell exprimierte Legionellen-Gene in verschiedenen Wachstumsphasen des Infektionszyklus identifiziert. Die Daten des dualen Sequenzierungsansatzes, die in dieser Arbeit generiert wurden, sind die ersten, die ein intrazelluläres, respiratorisches Bakterium untersuchen. Mit Hilfe dieser Daten können die Regulationen aller kodierender und nicht-kodierender RNAs von Pathogen und Wirt in einem großen, umfassenden Netzwerk dargestellt werden. Zusammengefasst haben die Ergebnisse dieser Arbeit die Kenntnisse des Infektionsprozess von L.p. und seine Wirtszellen vertieft. Die Daten werden dazu beitragen das komplexe Zusammenspiel zwischen ihnen besser zu verstehen, indem die in silico Konstruktion eines RNA-Interaktions-Netzwerkes ermöglicht wird. Darüber hinaus wird die vorliegende Studie helfen, potenzielle neue Kandidaten für Diagnose und Therapie zu etablieren.