Impact of the Transcription Factor HoxA9 on Toll-like Receptor-Mediated Innate Immune Responses and Development of Dendritic Cells and Macrophages

Ziel dieser Arbeit: Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind Sensoren des angeborenen Immunsystems, welche durch die Evolution konservierte mikrobielle Strukturen erkennen und als Mechanismen der ersten Verteidigungslinie gegen Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten zu betrachten sind. Eine Subfamilie stellen die intrazellulären TLRs dar, welche sich in unterschiedlichen endosomalen Kompartimenten befinden, um dort ihre Liganden, bestehend aus verschiedenen Typen von Nukleinsäuren, zu erkennen. Zu den intrazellulären TLRs gehören TLR3, 7, 8 und 9. TLR3 erkennt doppelsträngige RNA (dsRNA), TLR7 und 8 erkennen einzelsträngige RNA (ssRNA) und TLR9 wird durch DNA aktiviert, welche unmethylierte CpG-Sequenzen enthält. Zellen des angeborenen Immunsystems, wie dendritische Zellen (DCs) und Makrophagen, zeigen unterschiedliche Expressionsprofile intrazellulärer TLRs. Zudem kann die Funktion der einzelnen TLRs je nach Zelltyp variieren. Konventionelle dendritische Zellen (cDCs) und Makrophagen in Mäusen exprimieren TLR3, 7 und 9. Nach Aktivierung der TLRs mit dem jeweiligen Ligand kommt es zur Bildung und Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen wie IL-6. Zusätzlich wird bei der Aktivierung von TLR3 die Freisetzung von Typ I Interferonen, wie Interferon-α und -β (IFN-α/-β), induziert. Eine selten vorkommende Subpopulation von dendritischen Zellen, genannt plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs), hat die außergewöhnliche Fähigkeit, eine enorme Menge an IFN-α und -β nach Aktivierung von TLR7 und 9 freizusetzen. Zudem konnte an murinen pDCs gezeigt werden, dass TLR9 in diesem Zelltyp auch DNA ohne unmethylierte CpGSequenzen erkennen kann. Die molekularen Mechanismen zelltypabhängiger funktioneller Unterschiede von intrazellulären TLRs werden bisher noch nicht gut verstanden. Der Transkriptionsfaktor HoxA9, welcher eine Homöodomäne besitzt, spielt verschiedene wichtige Rollen in der Embryogenese und bei diversen Prozessen im Rahmen der Hämatopoese, wie beispielsweise die Erhaltung des Stammzellenstatus, Bildung von Progenitor-Zellen der B-Zell Reihe und bei der Entstehung von Leukämien. Der Einfluss auf die Entwicklung von B-Zellen wurde teilweise auf die transkriptionelle Regulierung des Zytokinrezeptors fms-like tyrosinkinase 3 (Flt3) in hämatopoetischen Progenitor-Zellen zurückgeführt. Flt3 und der passende Ligand Flt3L spielen jedoch auch eine entscheidende Rolle im Rahmen der Entwicklung und Homöostase von DCs. Unveröffentlichte Daten zeigten eine deutliche Überexpression der hoxa9 mRNA in murinen pDCs nach Aktivierung von TLR9. Basierend auf diesen Daten wird in dieser Studie der Einfluss desTranskriptionsfaktors HoxA9 auf die Funktion intrazellulärer TLRs sowie die Entwicklung von DCs und Makrophagen untersucht. Hierfür wurden HoxA9 Knockout (KO) Mäuse verwendet. Hypothese: Die Hochregulierung von HoxA9 in pDCs unter Aktivierung von TLR9 lässt einen Einfluss dieses Gens auf die TLR-vermittelte Funktion von DCs und Makrophagen vermuten. Die bekannte transkriptionelle Regulierung des Zytokinrezeptors Flt3 in Progenitor-Zellen der B-Zell Reihe durch HoxA9 könnte ebenfalls im Rahmen der DC Differenzierung eine Rolle spielen. Ergebnisse: HoxA9-/- Mäuse zeigten eine geringe, statistisch nicht signifikante, Hypozellularität der gesamten kernhaltigen Knochenmarkszellen. Dies bestätigte die Ergebnisse von anderen Arbeitsgruppen. In FACS-Analysen der gesamten Knochenmarkszellen konnte ex vivo eine signifikante Reduktion der Anzahl von BZellen, inklusive der B-Vorläuferzellen, bei HoxA9-defizienten Mäusen im Vergleich zum Wildtyp (WT) beobachtet werden. Vergleiche der unterschiedlichen DC Subpopulationen ergaben jedoch zwischen KO und WT keine Unterschiede, passend zu den Ergebnissen früherer Studien. TLR Stimulations-Experimente von gesamten Knochenmarkszellen und aus Knochenmark FACS-gesorteten pDCs zeigten in der KOGruppe eine deutlich gestörte IFN-α Sekretion nach Aktivierung von TLR7 und 9 ex vivo, welche statistisch signifikant war. FACS-gesortete cDCs waren jedoch, bezogen auf die TLR-Funktion, nicht verändert. Zudem konnten in in vitro generierten Flt3L-induzierten DC Kulturen, welche sowohl pDCs als auch cDCs enthalten, eine fast vollständig fehlende Sekretion von IFN-α sowie eine reduzierte Sekretion von IL-6 nach Aktivierung von TLR7 und 9 beobachtet werden. Darüber hinaus zeigte sich in den HoxA9defizienten Flt3L-induzierten Kulturen im Vergleich zum WT eine leicht reduzierte Rate an differenzierten Zellen, eine erhöhte Rate an toten Zellen sowie eine veränderte pDC/cDC Ratio. Die in vitro generierten HoxA9-/- GM-CSF-induzierten cDCs sowie die M-CSF-induzierten Makrophagen waren weder in den FACS-Analysen noch in den TLR Stimulations-Experimenten verändert, verglichen zum WT. Die Anzahl von pDCs und cDCs in primären Milzzellen mit HoxA9-Knockout zeigte sich in den FACS-Analysen unverändert zum WT. Die Sekretion von IFN-α war hingegen, ähnlich wie im Knochenmark, nach Stimulation von TLR7 und 9 im Vergleich zum WT reduziert. Eine genomweite Microarray-Analyse von ex vivo FACS-gesorteten pDCs aus dem Knochenmark, konnte eine veränderte Expression multipler Gene, z.B. des HoxA9 Kofaktors Meis1, bei HoxA9-Defizienz nachweisen. Fazit: Die Ergebnisse dieser Studie lassen auf eine essenzielle Rolle von HoxA9 im Rahmen der TLR-vermittelten IFN-α Sekretion von pDCs schließen. Hingegen kann kein Einfluss von HoxA9 auf die TLR-induzierten Immunreaktionen von cDCs und Makrophagen gezeigt werden. Die Differenzierung von DCs unter HoxA9-defizienten Bedingungen ist in vitro teilweise verändert. Dieser Effekt scheint jedoch in vivo kompensiert zu sein. Zunehmende Hinweise zeigen, dass pDCs bei unterschiedlichen Erkrankungen wie Virusinfektionen, Autoimmunerkrankungen und im Rahmen der Tumorgenese von verschiedenen Krebserkrankungen eine wichtige Rolle einnehmen. Dies unterstreicht die Wichtigkeit dieser Immunzellen. Der Transkriptionsfaktor HoxA9 rückt damit als ein potenzielles therapeutisches Ziel in den Fokus.