A key role for BID-mediated mitochondrial damage in oxidative cell death

Altersbedingte neuronale Erkrankungen, wie Alzheimer oder Parkinson sowie akute Hirnschädigungen nach Schlaganfall oder Schädel-Hirn-Trauma sind durch nachhaltige Störungen der zellulären Homöostase in Neuronen gekennzeichnet. Dies ist in der Regel verbunden mit einer Entgleisung der intrazellulären Calciumhomöostase, einem gestörten Redoxgleichgewicht und Energieverlust, was über die Schädigung der Mitochondrien weiter verstärkt wird und schließlich zum Zelltod führt. Folglich ist die Aufklärung biochemischer Signalkaskaden des neuronalen Zelltods eine wesentliche Voraussetzung dafür, neue und effektive therapeutische Konzepte zu entwickeln. Bislang konnten verschiedene Modalitäten des regulierten Zelltods in Neuronen identifiziert werden, darunter Mechanismen der Apoptose, Exzitotoxizität sowie regulierten Nekrose. Diese verschiedenen Mechanismen münden wahrscheinlich alle in einer Schädigung der Mitochondrien, die damit in der Regulation des neuronalen Zelltods eine entscheidende Rolle einnehmen. Trotz zunehmender Erkenntnisse über spezifische Signalwege des regulierten Zelltods steht bislang keine kurative Therapie für neurodegenerative Erkrankungen zur Verfügung. Frühere Arbeiten haben aufgezeigt, dass pro-apoptotische BCL-2 Proteine wie BID und BAX eine entscheidende Rolle bei mitochondrialen Mechanismen des Zelltods spielen. In vivo konnte nachgewiesen werden, dass BID an der neuronalen Apoptose entscheidend beteiligt ist, so dass die Hemmung dieses Proteins einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige Therapien darstellt. Hingegen sind die Beteiligung von BID und die Schädigung der Mitochondrien in nicht-apoptotischen Zelltodmodellen, wie z.B. der Ferroptose, weitgehend unklar. Neurone sind auf einen funktionierenden Energiestoffwechsel angewiesen, da sie für die Aufrechterhaltung des Membranpotentials, die Neurotransmittersysnthese sowie für die Wiederherstellung der Ionenhomöostase nach einem Aktionspotential viel Energie brauchen, was sie wiederum für Schäden durch Sauerstoff- und Energiemangel anfällig macht. Das Ziel dieser Studie war es, die Schlüsselmechanismen des regulierten oxidativen Zelltods aufzuklären sowie den Zeitverlauf entsprechend darzustellen und hier insbesondere die Rolle von BID bei der Schädigung der Mitochondrien zu charakterisieren. Dafür wurden mithilfe der CRISPR/Cas9 Technik Bid knockout Zellen generiert und deren Empfindlichkeit gegen die Ferroptose-Induktoren Erastin und RSL3 untersucht. Als weitere therapeutische Strategie wurde die Behandlung mit MitoQ analysiert, das reaktive Sauerstoffmoleküle spezifisch in den Mitochondrien abfängt. Ferner sollte die BID Kristallisation durch Entwicklung neuer rekombinanter Bid Konstrukte und Kristallisierungskonditionen optimiert werden. Im ersten Teil der Studie wurde die Regulation des oxidativen Zelltods in MEF und neuronalen HT22 Zellen untersucht. Im Modell der Glutamat-induzierten Oxytose konnte ein zeitabhängiger Verlust der mitochondrialen Atmung beobachtet werden. In diesem Modell konnte mithilfe des BID-Inhibitors BI-6c9 nachgewiesen werden, dass die mitochondriale Schädigung durch BID den kritischen Punkt im oxidativen Zelltod darstellt. Nach funktioneller und struktureller Schädigung der Mitochondrien kann der Zelltod nicht mehr aufgehalten werden. Die Analyse des Erastin-induzierten Zelltods ergab mechanistische Überschneidungen der bislang separat betrachteten Zelltod-Modalitäten von Oxytose und Ferroptose. Erastin verursachte ähnlich zur Oxytose den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und die Produktion von Lipidperoxiden. Diesen folgte der Zelltod innerhalb von ca. 8-10 Stunden. Das Auftreten mitochondrialer reaktiver Sauerstoffspezies und der Verlust der mitochondrialen Funktion wurde 6 Stunden nach Erastinexposition beobachtet, und trat zeitgleich mit morphologischen Veränderungen der Mitochondrien auf. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der Apoptose-induzierender Faktor AIF ebenfalls eine wichtige Rolle in der Erastin-induzierten Ferroptose spielt. Die siRNA-vermittelte Depletion von AIF verminderte den ferroptotischen Zelltod analog zu früheren Befunden aus dem Modell der Glutamat-induzierten Oxytose. Der zweite Teil befasste sich mit der Beteiligung des BCL-2 Proteins BID in mitochondrialen Prozessen des oxidativen Zelltods. Die Depletion von BID mittels siRNA oder CRISPR/Cas9 schützte die Zellen vor einer Schädigung der Mitochondrien und Ferroptose. Dies unterstreicht die entscheidende Rolle der BID-Aktivierung bei den Schlüsselmechanismen der Mitochondrienschädigung im oxidativen Zelltod. Folgerichtig führte die Reexpression von aktiviertem tBID zu einer Auslöschung des protektiven Effekts durch die BID-Depletion und induzierte wiederum Lipidperoxidation, mitochondriale Schädigung und Zelltod. Abgesehen von der gemeinsamen Beteiligung von BID in Oxytose und Ferroptose konnten die mechanistischen Übereinstimmungen zudem dadurch nachgewiesen werden, dass der Ferroptoseinhibitor Liproxstatin HT22 Zellen auch gegen Oxytose schützte. Die direkte Inaktivierung des Enzyms GPX4 mithilfe von 1S, 3R-RSL3 und die gleichzeitige Protektion der Mitochondrien mithilfe von MitoQ belegen ebenfalls die signifikante Bedeutung der Mitochondrienschäden im Zelltod durch oxidativen Stress. Dieser Teil der Studien untermauerte auch die entscheidende Rolle von BID, da Bid KO Zellen auch hier weniger sensibel auf die RSL3-Behandlung reagierten. Zusammengefasst unterstreichen diese Ergebnisse eine besondere Beteiligung von BID in den beiden Zelltodmodellen Oxytose und Ferroptose und belegen, dass die Aktivierung von BID, die Mitochondrienschädigung und AIF-Abhängigkeit in diesen bislang getrennt betrachteten Zelltodmodalitäten identisch sind. Abschließend sollte die 3D-Struktur von BID mittels Röntgenstrukturanalyse untersucht werden. Dazu wurden neuartige rekombinante Bid Konstrukte und deren Reinigung etabliert. Zum ersten Mal konnten Kristalle reproduzierbar erzeugt und optimiert werden, in dem die Bid Konstrukte und Kristallisationsbedingungen sukzessive verbessert wurden. Um das Phasenproblem zu lösen, wurden Selenomethionin-Kristalle gezüchtet, deren errechnete Elektronendichten am Ende nicht ausreichten, um die molekulare Struktur abschießend zu klären. Dennoch bieten die erhobenen Daten eine vielversprechende Grundlage für weitere Optimierungsversuche.